[发明专利]一种构建长片段测序文库的方法

说明书

本发明提供了一种构建长片段测序文库的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：1)制备含有单链DNA的5184孔板；2)将所述单链DNA等量分装到5184孔板每个孔中；3)将全基因组扩增反应体系分装到步骤2)处理后的5184孔板每个孔中，反应；4)将片段化反应液分装到步骤3)处理的5184孔板每个孔中，反应；5)将步骤4)处理后的5184孔板每个孔中的核酸分子添加不同标签序列，即得到测序文库。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种构建长片段测序文库的方法。

背景技术

新一代高通量并行测序仪使基因组学领域发生了革命性变化，基因测序所需成本和时间大大降低，同时一些新的应用，诸如宏基因组测序，基因结构变异和基因表达分析也被开发了出来。尽管如此，目前其他物种基因组的组装，离达到人类基因组项目设定的标准的，常规的基因组还有非常长的距离。受限于测序原理和技术瓶颈，现有的高通量并行测序仪的测序读长分布从几百碱基到几千碱基不等，而需要进行研究的基因组或基因组元件的或可多达几亿个碱基，这要求生物信息学家将这些片段化的信息重新还原成生物体本身的长片段染色体信息，即对测序生成的短片段进行组装。

事实上，基因组的组装效果受到很多方面的制约，除了制定的测序策略，测序数据质量，以及所使用的组装软件等人为因素外，待研究的基因组的自身特性也会影响基因组组装的效果，其中较为重要的两个因素是基因组中的重复区域和基因组的杂合程度。由于现有测序手段的读长较短，无法跨越重复区域因而造成拼接失败。而基因组的杂合程度过高则会导致组装软件将同源染色体单独组装出来，从而造成组装的基因组偏离于基因组的真实情况。在不改变现有测序仪读长的情况下，这些因素无法通过改进组装拼接算法完全消除。此外，潜在的测序错误，以及文库构建过程中扩增导致的偏向性及错误都会对组装效果产生负面影响。

因此越来越多的研究者试图通过在实验设计方面进行改进从而提升基因组拼装效果。针对基因组重复区域，传统的方法一般通过增加文库跳跃长度来辅助组装，如构建不同长度的Mate pair jump文库或Fosmid文库，用于跨过不同大小的基因组重复区域。另外还可以采用混合测序类型的方法，如使用PacBio测序仪长读长序列生成长脚手架序列，然后利用illumina测序仪的短读长进行错误修正，从而达到较好的组装效果。

而对于高杂合度引起的组装问题，可以通过单倍型组装定相(Phasing)来解决。即通过实验手段将单倍体信息从多倍体信息中分离出来，从而使单倍体型被完整的组装出来。目前已经有一些研究使用不同的研究手段获得了样品的单倍体型信息，这些手段包括：1.通过对样品以及样品的父本进行全基因组测序进而获得样品的单倍体型信息。2.通过使用Fosmid测序方法进行单倍体型测序。3.在细胞分裂中期，使用显微操作技术将染色体分离并测序，进而获得单倍体型信息。4.通过临近随机连接法进行单倍体测序。

然而，以上几种单倍型定相方法均具有一定的局限性：1.同时对父代和子代样本进行测序，然后根据基因型进行单倍型定相的方法要求同时拥有父本和母本的样品，这大大限制了它的使用范围，并且该方法无法对De novo突变进行检测。2.使用Fosmid测序的方法需要至少一周的文库制备时间，包含大量建库实验，因此该方法需要微克级的样品作为起始。无法针对临床少量样品进行分析。3.染色体分离方法需要有复杂的专业显微操作设备，同时要求实验人员的操作水平非常高。4.受限于实验原理，临近连接法检测到的突变体有限，只能检测到80％左右的SNV，不能满足临床分析的需要。因此，为了应对个体化医疗的需要，急需一种高准确度，高覆盖度，低成本，低起始量，实验条件相对简便的单倍体型测序技术。