[发明专利]生产L-谷氨酰胺的菌株和生产L-谷氨酰胺的方法

说明书

本发明涉及食品工业技术领域，尤其涉及生产L‑谷氨酰胺的菌株和生产L‑谷氨酰胺的方法。本发明研究表明，单独pyc改造不能提高谷氨酸棒杆菌积累谷氨酰胺的能力，但pyc改造与odhA弱化改造配合，则可以大幅提高谷棒产谷氨酰胺的水平。说明，pyc高表达与odhA弱化表达，对合成谷氨酰胺具有协同促进作用。本发明以保藏编号为CGMCC No.13404的谷氨酸棒杆菌为出发，通过弱化odhA及增强pyc的表达水平，构建得到L‑谷氨酰胺基因工程改造菌。该菌株能够实现发酵过程中L‑谷氨酰胺的高效积累，L‑谷氨酰胺可达28.9g/L。

技术领域

本发明涉及食品工业技术领域，尤其涉及生产L-谷氨酰胺的菌株和生产L-谷氨酰胺的方法。

背景技术

谷氨酰胺不仅是合成蛋白质的基本氨基酸之一，还是许多重要化合物如嘌呤、嘧啶，及其它氨基酸合成的氨基供体。谷氨酰胺能够对抗消化道溃疡，维持正常的肠胃功能，保证氮代谢平衡，及调节人体正常的酸碱平衡，具有重要的免疫和营养功能。

目前，谷氨酰胺的主要生产方法为微生物发酵法，微生物发酵法反应条件温和，产品原料丰富，逐步取代了传统的酶法和化学合成法。在高NH⁴⁺、低pH的的情况下，谷氨酸经谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺。人们在从谷氨酸生产菌中筛选谷氨酰胺生产菌方面做了许多研究。事实上，现在的谷氨酰胺生产菌有很多都是从谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌改造而来。

近年来，随着谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC 13032基因组测序的完成，以及棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过分子生物学手段对谷氨酸棒杆菌进行相关改造成为现实。谷氨酰胺在生物体内的合成途径也已相继报道。

腺苷酰转移酶(ATase)是谷氨酰胺合成酶(GS)的腺苷酰化修饰酶。所谓腺苷酰化修饰就是AMP以共价键方式与肽链上的酪氨酸残基结合产生GS(AMP)的过程，GS的腺苷酰化和去腺苷酰化都由腺苷酰转移酶催化。腺苷酰化会使GS的活性降低或丧失。另外，GS的腺苷酰化修饰失活及其逆过程也受到铵离子浓度的调控。在限制铵盐的培养条件下，生长到稳定期的细胞内的GS是未被腺苷酰化修饰的。而在过量铵盐的培养条件下，腺苷酰化程度增强，GS酶活力下降甚至失活(黄星，过程工程学报.2008,8(1):135-139)。因此，解除对GS的腺苷酰化修饰作用可以很大程度提高L-谷氨酰胺的产量。

谷氨酸棒杆菌中存在谷氨酰胺酶(GLS)，该酶可分解谷氨酰胺成为谷氨酸。高铵离子浓度和低pH可抑制该酶的活性。传统谷氨酰胺发酵中，通过降低发酵中后期培养基的pH，可实现高谷氨酰胺积累。在谷氨酸棒杆菌中缺失该基因，可减少谷氨酰胺的分解代谢。

虽然上述举措都实现里利用谷氨酸棒杆菌来生产L-谷氨酰胺，但谷氨酰胺的产量仍有待进一步的提高。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供生产L-谷氨酰胺的菌株和生产L-谷氨酰胺的方法，本发明提供的生产L-谷氨酰胺的菌株能够将谷氨酰胺的产量提高至28.9g/L。

本发明提供了弱化odhA表达的重组菌株；其起始菌株为谷氨酸棒杆菌；弱化为使odhA基因的起始密码子由ATG突变为GTG。

α-酮戊二酸是谷氨酸的直接前体，而后者又是谷氨酰胺的直接前体。本发明将odhA的表达弱化，以期使更多代谢流从TCA循环的α-酮戊二酸节点通往谷氨酸合成方向，继而在增强的谷氨酰胺合成酶的作用下，积累更高量的谷氨酰胺。本发明通过进一步修饰该谷氨酰胺产生菌的odhA基因(编码α-酮戊二酸脱氢酶E1o亚基)，降低该基因的表达水平，从而减弱了α-酮戊二酸的进一步氧化脱羧，导致更多代谢流从TCA循环进入谷氨酸及谷氨酰胺合成方向。修饰手段为将odhA编码基因的起始密码子由ATG改为GTG，降低该基因的起始翻译效率。

本发明中，重组菌株包括编码突变pyc蛋白的DNA分子，所述突变pyc蛋白具有P458S突变。