[发明专利]一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法，该试剂盒包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液。其中，脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N‑羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素‑生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素‑生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。与国外Diadexus公司的酶联免疫试剂盒比较，本发明制备的试剂盒大大提高了对脂蛋白相关磷脂酶A2分析的灵敏度和精密度，且操作简便、快速、更易于推广。

技术领域

本发明属于医学生物类免疫检测试剂领域，具体涉及一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法。

背景技术

脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)属于磷脂酶A2超家族，主要由成熟的巨噬细胞和T淋巴细胞合成和分泌，受炎症介质的调节。Lp-PLA2主要以与脂蛋白结合的形式存在，它既能通过水解血小板活化因子、氧化磷脂等炎症介质达到抗动脉硬化的作用，同时又具有水解氧化低密度脂蛋白中的氧化磷脂，起到促动脉粥样硬化的作用。它的双重特性，使之成为关注的热点。

近年来越来越多的研究证明，Lp-PLA2是血管内皮炎症的独立危险因子，也是国际公认的一个反映心血管病、冠心病以及缺血性脑卒中疾病的炎性反应标志物，与其他炎性因子比较，Lp-PLA2受其他因素的影响较小，检测具有更高的灵敏度和特异性，可作为预测心血管病、冠心病以及缺血性脑卒中事件的风险指标，用于对患者心血管疾病的早期诊断、疗效观察及预后评价。

因此，检测血浆或血清中Lp-PLA2的生物活性将具有重大的临床意义和市场前景。目前，市面上测定Lp-PLA2的方法主要有：1)分光光度法、2)胶乳增强比浊法、3)放射性免疫法(RIA)、4)酶联免疫法(ELISA)。其中，1)分光光度法主要以PAF硫酯类或其类似物作为底物，Lp-PLA2将底物水解后，释放带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质性质不稳定，马上分解成4-硝基苯酚，在405nm处可以测得由该变化引起的吸光度的改变，由此可以测定酶的活性，但该方法检测的灵敏度不高。2)胶乳增强比浊法，Lp-PLA2在磷酸盐缓冲系统中与试剂中结合有抗Lp-PLA2抗体的致敏乳胶颗粒发生抗原抗体反应，在促聚剂聚乙二醇作用下产生凝集以使浊度上升，在546nm波长检测反应液吸光度的变化，其变化程度与样本中的Lp-PLA2含量成正比，但该方法容易受血脂浓度影响产生假阳性，且不适合大批量、自动化检测。3)放射性免疫法，该方法根据竞争机制原理，125I-Lp-PLA2与抗体的结合量与标准品或样品中的Lp-PLA2的含量呈一定函数关系。用免疫分离剂将结合部分与游离部分分离后，测定结合部分的放射性强度，通过数据处理可求出样品中Lp-PLA2的浓度值，但该方法存在放射性污染的安全问题。4)酶联免疫法，此方法应用双抗体夹心法测定全血样本中人Lp-PLA2的水平。用纯化的抗LP-PLA2抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入Lp-PLA2，再与辣根过氧化物酶标记的Lp-PLA2抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物显色。用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算样品中Lp-PLA2的含量，但该方法重复性较差，精密度较低。

新兴的化学发光免疫法(CLIA)、电化学发光免疫法(ECLI)和时间分辨免疫荧光法(TRFIA)等具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验的分析手段。但目前，具有自主知识产权的国产Lp-PLA2检测试剂盒较少，均依靠国外进口，价格昂贵，给患者带来很大经济负担，不利于基层普及。基于此，国内本领域的学者致力于NSE试剂盒的研发，如公开号为CN 103698535 B的中国专利申请“脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测试剂盒及制备、操作方法”以免疫磁珠微粒与化学发光酶免疫分析技术相结合，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。又如公开号为CN 104634970 A的中国专利申请“用于检测脂蛋白相关磷脂酶A2的试剂盒及其制备和应用”以抗体包被磁球和示踪标记物标记抗体结合，用于检测Lp-PLA2，具有高重复性、高准确性和高灵敏度。