[发明专利]一种用于口服蛋白免疫载体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于口服蛋白免疫载体的制备方法，属于医药领域。

背景技术

疫苗作为人类对抗疾病的有效防御武器，在抵抗传染性疾病中起着重要的作用。很多传染性疾病是由于微生物病原体入侵呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道而引起的，而粘膜免疫系统分泌的IgA能有效地阻止微生物病原体的入侵。在口服给药后，由肠相关淋巴组织(GALT)分泌IgA能转移到呼吸道，泌尿生殖道等较远的黏膜位点，从而抵御病毒和微生物病原体的入侵。但是目前市场上的大多数疫苗是通过皮下注射或是肌肉注射来进行接种的，这种接种方式仅仅能诱导全身性免疫，而不能引发粘膜免疫系统。

与注射疫苗相比，粘膜疫苗有着诸多优势。它不仅能引发全身性免疫系统还能引发粘膜免疫系统，使得机体产生黏膜IgA和血清IgG抗体，还能避免注射疫苗带来的疼痛，降低注射感染的风险。此外，当抗原在机体的某一黏膜部位给药后，不仅能在给药部位诱导产生局部粘膜免疫反应，还能在距离给药部位较远的黏膜部位产生免疫反应，这使得黏膜成为口服疫苗免疫的理想位点。虽然鼻腔、直肠及阴道等部位给药后，都能诱导机体的粘膜免疫反应，但是这些部位不足以对抗肠道感染，并且给药不方便。

而当疫苗口服给药后，在机体内能产生有效的局部粘膜免疫，也增加了病人的顺应性，而且不需要专业训练。研究表明当颗粒进入体内后，滤泡相关上皮细胞能将其转移到派尔式(PPs)结上，位于PPs结上的M细胞再将抗原摄取，从而引发机体的粘膜免疫作用。而当蛋白疫苗直接暴露在胃肠道内时，胃肠道内的环境和各种酶的作用会影响蛋白疫苗的完整性，导致蛋白疫苗不能被有效摄取，进而无法引发机体的免疫系统。

研究人员在口服生物降解载体的研究中已经取得了重大突破，但这类不稳定的材料，如脂质体，聚合物纳米粒等，在水中会造成疫苗的泄露，这会使得疫苗直接暴露在胃内的酸性环境中，导致疫苗失效，从而达不到预防或治疗的效果。

自2006年，多孔硅材料SBA-15首次作为免疫佐剂的研究后，无机多孔材料成为口服疫苗载体的研究热点。介孔二氧化硅纳米粒子结构稳定，生物相容性好，毒性低，表面孔隙多，在体内胃肠道内稳定，还可以通过改善合成条件来控制粒子的粒径和孔径大小。

研究表明在无机载体表面包裹一层有机材料，不仅可以调节药物在机体内的释放，还能有效保护药物进入体内后免受胃肠道环境的破坏。

壳聚糖(chitosan，CS)是一种阳离子聚合物，作为药物载体具有良好的生物相容性、生物可降解性，无毒等优点，还具有打开肠上皮细胞间紧密连接的能力。壳聚糖通过静电作用吸附在介孔二氧化硅纳米粒表面，这样不仅可以保护疫苗不受胃肠道环境的破坏，还能促进介孔二氧化硅纳米粒子渗透进入粘液层，增加M细胞的摄取，并通过激活树突状细胞、巨噬细胞来增强机体的免疫反应。

发明内容

本发明针对蛋白疫苗经口服后，在胃肠道会因各种酶和环境PH值的影响，导致蛋白疫苗失活，从而无法达到预防或治疗的效果，此外，肌肉或皮下注射疫苗只能诱导机体的全身性免疫而不能诱导机体产生粘膜免疫等问题，设计了一种用于口服蛋白疫苗的载体，通过黏膜滤泡相关细胞对载体的转运作用，将含有蛋白抗原的载体粒子运输至巨噬细胞，树突细胞等抗原呈递细胞将其摄取，再处理和呈递给B、T细胞，从而诱导产生机体的免疫应答。

本发明以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为模板剂，以正硅酸四乙酯(TEOS)为硅源，以乙醇和乙醚为助溶剂，当TEOS水解时放热会使助溶剂乙醚挥发，从而在介孔二氧化硅的表面形成大孔结构，制得具有大孔结构的介孔二氧化硅纳米粒载体。

本发明提供了一种用于口服蛋白免疫载体的制备方法，具体制备过程是：

(1)将模板剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于去离子水中，依次加入氨水，乙醇，乙醚在室温下剧烈搅拌至溶液澄清，快速滴加正硅酸四乙酯(TEOS)，剧烈搅拌反应，得到白色固体沉淀；

(2)将步骤(1)中所得的沉淀进行抽滤，用乙醇和水洗涤，将所得沉淀物置于烘箱中干燥；

(3)将步骤(2)干燥后的固体粉末置于硝酸铵/乙醇溶液中加热搅拌回流，除去介孔二氧化硅中的模板剂(CTAB)；

(4)将模型药物牛血清蛋白(BSA)溶于磷酸盐缓冲液中，溶胀过夜；

(5)将BSA溶液与处理过的介孔二氧化硅按一定的质量比例，置于磷酸盐缓冲液中，4度下搅拌24小时，离心，冻干沉淀物；

(6)壳聚糖(CS)溶于1％醋酸溶液中，磁力搅拌至其完全溶解，用氢氧化钠溶液调节壳聚糖溶液PH至5.5左右；