[发明专利]一种稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的特异引物和检测方法与应用

说明书

本发明公开了一种稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的特异性引物，该引物扩增序列为稻纵卷叶螟颗粒体病毒（Cnaphalocrocis medinalis granulovirus）特有。本发明还公开了一种稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的方法，该方法是将上述引物与待测稻纵卷叶螟样品的总DNA进行PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析，以确定稻纵卷叶螟是否感染颗粒体病毒。本发明进一步公开了上述特异性引物的应用。本发明检测方法快速、准确、灵敏度高，能够在一个PCR反应中检测病毒是否感染，对一些潜在感染且未发病的幼虫也能检测出，可以用于病毒流行检测和病毒制剂检测及实际应用效果的评价。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种应用于稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的特异性引物和检测方法与应用。

背景技术

稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Güenée)是为害水稻的重要迁飞性害虫，其发生水平与气候、水稻品种等呈一定的相关性，爆发时失治田块损失超过30％，对水稻产量造成重大影响，严重威胁我国粮食安全。目前稻纵卷叶螟的防治主要使用化学农药，随着“十三五”药肥减量使用政策的逐步落实，及对安全、优质、无公害农产品需求的提高，亟需开发新型、安全、高效的生物农药来防治稻纵卷叶螟。稻纵卷叶螟颗粒体病毒(CnmeGV)是对稻纵卷叶螟具有较强致病力的杆状病毒，在田间能引起疾病流行，是一种潜在的生物防治药剂。同时，CnneGV与苏云金杆菌Bt的联合作用也显示了对稻纵卷叶螟较好的控制作用。目前用于检测CnmeGV的技术仍是空白，过去检测其它颗粒体病毒主要有免疫法、ELISA、电泳法等蛋白质分析法。这些技术相对来说比较繁琐，对实验人员要求较高，而PCR技术具有较高的灵敏性、特异性和操作简便性，已经成为实验室常规技术。通过特异性引物PCR检测技术的建立，不仅可以快速鉴别稻纵卷叶螟感病情况，用于病毒的流行病检测，而且为后期病毒产品的检测提供依据。

发明内容

针对CnmeGV检测技术的空白，本发明通过设计CnmeGV特异性引物，并建立检测方法，该方法能快速、准确鉴定出稻纵卷叶螟未表症但感病的虫体，为病毒的流行检测提供方法。

本发明的第一个目的是提供一种CnmeGV PCR检测的特异性引物，所述引物为：

上游引物：5′-CTTGCAACAAGTTCGC-3′

下游引物：5′-CCATGATGTAGTGACACG-3′

所述引物扩增的目标核苷酸序列为：

5′-CAATTGCAACAAGTTCGCATAAAAGCTGGTAATAAAAAAGCTTTTAAACAAATTAATTCGATTATACAACCTGGACGTTTTGAAGTATTGTTTACTTTGCAAAAAAACCTTTAGAAGAACAACAACAACAACAACAACAAGAAGAAGAAGAAAAGCAAAATTTACATGGATTGAGTTGAGCGGACTAAAATCGTGTCACTACATCATAAC-3′

本发明的第二个目的是提供一种CnmeGV PCR检测的方法，该方法是将上述引物与待测感病稻纵卷叶螟虫体样品的总DNA进行PCR反应，反应结束后对PCR产物进行电泳分析，以确定稻纵卷叶螟是否感染CnmeGV，具体包括以下步骤：

(1)引物的合成：合成权利要求1中所述的特异性引物；

(2)DNA模板提取：提取稻纵卷叶螟虫体样品的总DNA；

(3)PCR扩增反应：以步骤(2)提取得到的总DNA为模板，以步骤(1)中合成的特异性引物为引物，进行PCR扩增反应；(4)PCR产物分析：将步骤(3)中得到的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分析，所述引物扩增的目标核苷酸序列为：