[发明专利]新的抗PD-1纳米抗体及其应用

说明书

本发明涉及一种特异性针对人程序性细胞死亡蛋白PD‑1的纳米抗体。本发明公开了一种抗PD‑1的纳米抗体，该抗体具有阻断PD‑1与其配体PD‑L1相互结合的作用。本发明公布了这种纳米抗体及编码该纳米抗体的核苷酸序列，相应的表达载体和能够表达该纳米抗体的宿主细胞，以及本发明纳米抗体的生产方法。同时还公布了人源化的PD‑1纳米抗体序列，人源化后的纳米抗体依然具有阻断PD‑1与其配体PD‑L1相互结合的功能，保留较高的亲和力。

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及针对于程序性细胞死亡蛋白PD-1的纳米抗体及其氨基酸序列。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death-1,PD-1)，也被称为CD279(分化簇279)，是一种在人体中由PDCD1基因编码的蛋白质。程序性细胞死亡蛋白1是一个含有268个氨基酸的I型跨膜蛋白，它的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域(21-170位氨基酸)、疏水的跨膜区(171-191位氨基酸)以及胞内区(192-288位氨基酸)。胞内区包括C端和N端氨基酸残基，含有2个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)，和免疫受体酪氨酸开关基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM)。PD-1是一个细胞表面受体，属于免疫球蛋白超家族，主要表达在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞表面。PD-1结合两个配体，程序性细胞死亡配体1(programmed cell death 1ligand 1,PD-L1,B7-H1)和程序性细胞死亡配体2(programmed cell death 1ligand 2,PD-L2,B7-DC)。

静息状态下的T细胞不表达PD-1，当T细胞被激活时，PD-1依靠TCR招募下游信号分子被诱导表达。T细胞的激活会产生多种细胞因子，例如IL-2、TNF-a和IFN-γ等。IFN-γ的产生可以诱导PD-1的表达上调。PD-1与PD-L1的结合抑制了T细胞的增殖，降低T细胞的活性。正常的机体利用抑制性受体和配体的结合来影响T细胞的分化、增殖和激活，降低T细胞的激活水平，以保持适度的免疫反应，减少对正常组织和器官的损伤。然而肿瘤细胞可以利用这些抑制性的免疫检查点逃避T细胞对其的识别、攻击和杀伤作用，从而正常的生存和增殖。研究表明，PD-1的表达被高度上调在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)上，例如在乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，黑色素瘤，非小细胞肺癌和肝癌中。与此同时，多种类型的肿瘤细胞表达PD-L1。PD-L2则表达在巨噬细胞，DC细胞，Th2辅助细胞和部分肿瘤细胞上。PD-1和PD-L1/PD-L2在肿瘤病人体内的诱导表达或表达上调与肿瘤的免疫逃避密切相关。

使用单克隆抗体治疗肿瘤是一个快速发展的领域。毋庸置疑，单克隆抗体治疗癌症是一个巨大的成功，它使我们向个性化治疗更进一步。到目前为止，已经大约有二十多种单克隆抗体经过了FDA批准并成功进入了市场。其中大多数通过结合跨膜受体或可溶性配体，然后干预它们的信号转导通路，抑制肿瘤细胞的增殖和血管生成。然而，由于单克隆抗体大的尺寸(～150kDa)，导致了有限的肿瘤渗透和较慢的分布。相对于单克隆抗体，纳米抗体具有尺寸小，热稳定性强和可溶性好的特征。而且纳米抗体相对容易通过细菌，酵母或哺乳动物细胞，以一种合理的花费大规模生产。分析发现，VHH序列与人源VH基因Ⅲ家族序列具有较高的同源性，这可能暗示了纳米抗体具有低的免疫原性。就肿瘤治疗而言，纳米抗体可以被使用来特异性靶向肿瘤细胞或者肿瘤脉管系统的抗原，阻断其信号通路，抑制肿瘤的生长。此外，纳米抗体还可以被用来阻断抑制型受体和配体的结合，刺激激活型受体和配体的结合，来恢复或增强效应T细胞对肿瘤的正常杀伤作用。纳米抗体具有很多的优点，将会在肿瘤的免疫治疗中发挥更加巨大的作用。本发明期望利用纳米抗体技术获得具有阻断PD-1与PD-L1相互结合的PD-1纳米抗体，从而应用于肿瘤的免疫治疗。

发明内容