[发明专利]大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体菌株，其构建方法及其应用

权利要求书

1.大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的VdKu80基因敲除突变体菌株VdXS11-ΔVdKu80，其特征在于，所述突变体菌株保藏号为CGMCC No.12873，并且所述变体菌株VdXS11-ΔVdKu80在表型上与野生型菌株相一致。

2.如权利要求1所述的大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体菌株，其特征在于，所述VdKu80基因被潮霉素抗性基因所替代。

3.如权利要求1所述突变体菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用split-marker方法，按照如下步骤构建大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体：

1A)以大丽轮枝菌基因组DNA为模板，分别以2对PCR扩增特异性引物Ku80-5F/Ku80-5R、Ku80-3F/Ku80-3R为引物进行PCR扩增，获得大丽轮枝菌VdKu80基因上游片段VdKu80 5F和下游片段VdKu80 3F；其中，所述引物Ku80-5F的序列号为SEQ ID NO.1；所述引物Ku80-5R的序列号为SEQ ID NO.2所述引物Ku80-3F的序列号为SEQ ID NO.3；所述引物Ku80-3R的序列号为SEQ ID NO.4；所述上游片段VdKu80 5F的序列号为SEQ ID NO.36；所述下游片段VdKu80 3F的序列号为SEQ ID NO.37。

1B)以质粒gGFP为模板，以Hyg-For/Hyg-Rev为特异性引物进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段Hygromycin片段，其中所述引物Hyg-For的序列号为SEQ ID NO.5；所述引物Hyg-Rev的序列号为SEQ ID NO.6；所述Hygromycin片段的序列号为SEQ ID NO.38；

1C)将VdKu80 5F、VdKu80 3F片段和Hygromycin片段分别与pMD^TM19-T Vector质粒进行连接反应，获得VdKu80 5F重组质粒、VdKu80 3F重组质粒和Hygromycin重组质粒；

1D)以VdKu80 5F重组质粒为模板，以Ku80-5F/Ku80-5RO为引物，进行PCR扩增得到VdKu80 5FO片段，其中所述引物Ku80-5RO的序列号为SEQ ID NO.7；以VdKu80 3F重组质粒为模版，以Ku80-3FO/Ku80-3R为引物，进行PCR扩增得到VdKu80 3FO片段，其中所述引物Ku80-3FO的序列号为SEQ ID NO.8；以Hygromycin重组质粒为模版，以M13F/M13R为引物，进行PCR扩增得到HygromycinO片段，其中所述引物M13F的序列号为SEQ ID NO.9；所述引物M13R的序列号为SEQ ID NO.10；

1E)以VdKu80 5FO片段和HygromycinO片段为模板，以Ku80-5F/HY-R为引物，进行融合PCR扩增，获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体1：VdKu80 5F+2/3Hyg片段，其中，所述引物HY-R的序列号为SEQ ID NO.11；以VdKu80 3FO片段和HygromycinO片段为模板，以YG-F/Ku80-3R为引物，进行融合PCR扩增，获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体2：2/3Hyg+VdKu803F片段，其中所述引物YG-F的序列号为SEQ ID NO.12；

2)利用PEG介导的方法，将VdKu80基因敲除载体导入野生型大丽轮枝菌XS11菌株的原生质体内，获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除的转化子；

3)利用PCR方法对大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子进行筛选。