[发明专利]纯化同时复性大规模制备SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用阴离子交换层析柱纯化同时复性SA-hGM-CSF融合蛋白的方法。

背景技术

癌症已经严重威胁到人类的健康，据世界卫生组织(WHO)预测到2020年全球癌症发病人数将高达2,000万人。传统治疗肿瘤的方法有三种：手术、化疗以及放射疗法，然而这些方法在应用上都有它们的局限性。利用手术切除肿瘤的方法只能针对原发癌而对转移癌束手无策，化疗的方法在杀伤肿瘤细胞的同时还会杀伤体内的正常细胞，使患者备受折磨。而放疗亦受到癌症部位的限制。因此，寻找出新型治疗癌症的方法已经刻不容缓。近年来，随着免疫学和基因工程的不断发展，免疫治疗癌症的方法得到了国内外学者的追捧，它是一种通过靶向给予抗癌药物从而调节患者免疫功能并有效杀伤肿瘤细胞的方法，该方法在临床治疗上显示出了特异性强、靶向性好和可持续作用等优点，从而被广泛使用。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种可以用来生产肿瘤疫苗和临床治疗的免疫蛋白，是造血生长因子家族成员之一，自上市开始，GM-CSF就因其疗效好，副作用小而被广泛使用来治疗肿瘤。链亲和素(SA)是从Streptomyces avicllrdi链霉菌中分离出来的一种不带任何糖基的可溶性蛋白，在天然的状态下呈现出四聚体的形式。它可以与生物素高效专一地特异性结合，通过这个作用可以实现生物多级放大效应。利用上述两个蛋白质的特性成功构建了SA-hGM-CSF双功能融合蛋白以及细胞膜表面修饰技术平台。

细胞膜表面锚定修饰技术就是利用细胞膜表面带有易生物素化的蛋白质以及生物素与链亲和素之间可以高效专一结合的这两个特性构建的，首先将经过酒精灭活处理的肿瘤细胞生物素化后借助链亲和素与生物素特异结合的原理将链亲和素标记的免疫刺激因子双功能融合蛋白锚定在肿瘤细胞表面，从而制备出肿瘤治疗性疫苗。

基于上述平台，本实验室已发现SA-hGM-CSF双功能融合蛋白制备的肿瘤疫苗在小鼠的浅表性膀胱癌和前列腺癌中有显著的预防和治疗效果。因此，为了大规模生产肿瘤疫苗需要大量的SA-hGM-CSF双功能融合蛋白。由于SA-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在，要制备大规模具有高纯度和生物学活性的SA-hGM-CSF双功能融合蛋白就需要对其进行纯化和复性。传统的纯化复性所获得的SA-hGM-CSF双功能融合蛋白的产量有限，而且费物耗时，不能满足制备肿瘤疫苗的需求。阴离子交换层析是依据溶液中不同蛋白质带有不同的负电荷从而对蛋白质进行分离的方法，该方法不受设备和大规模工艺的限制，能够一次性大规模纯化同时复性SA-hGM-CSF融合蛋白，既节省了耗材，又节约了时间，因此被广泛使用。目前，在该领域尚无成功大规模生产SA-hGM-CSF双功能融合蛋白的先例。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种利用阴离子交换层析规模化制备SA-hGM-CSF双功能融合蛋白的方法。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案(工艺流程见图一。)：

(1)包涵体洗涤溶解：将制备得到的的包涵体进行洗涤后，用8M脲素溶解液溶解SA-hGM-CSF融合蛋白；

(2)平衡：在纯化仪上连接阴离子交换层析柱后，将阴离子交换层析柱子用平衡液进行平衡处理至基线稳定；

(3)上样：将步骤(1)中所得的SA-hGM-CSF融合蛋白溶液的浓度调节至2mg/ml后上样到步骤(2)中经平衡液平衡后的柱上；

(4)再平衡：继续注入平衡液到经上样后步骤(3)的阴离子交换柱中，经2cV的再平衡去除一定的杂蛋白；

(5)复性：线性逐步从100％平衡液换到100％复性液中以形成脲素梯度从而诱导吸附于DEAE FF树脂上的SA-hGM-CSF蛋白质复性，再运行2个柱体积的复性液以使平衡液被完全置换出来；

(6)洗脱：用洗脱液将复性蛋白洗脱下来，收集洗脱峰测定蛋白质纯度和活性(见图2)。

(7)本发明的包涵体洗涤溶解的方法为：将SA-hGM-CSF包涵体按质量∶体积＝1∶20的比例依次用包涵体洗涤液A，B，C，D，E液分别溶解后放在磁力搅拌器上进行搅拌洗涤3h，然后用12,000rpm，4℃离心30min，去上清并用下一个洗涤液对沉淀进行重悬再洗涤。其中，C液可洗涤过夜。将经过E液洗涤后离心所得的沉淀用8M脲素溶解液溶解过夜后用12,000rpm，4℃离心30min，弃去多余的沉淀后所得上清即为含SA-hGM-CSF蛋白质的溶液。