[发明专利]确定质粒药物是否具有生物活性的方法、装置及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及确定质粒药物是否具有生物活性的方法、装置及确定质粒药物生产工艺的方法。

背景技术

质粒药物主要是采用E.coli原核表达系统生产的DNA重组制品。质粒药物可根据市场的需要，灵活设计目标蛋白的表达序列到质粒药物的载体上，进而表达所需要的目标蛋白。

质粒药物具有靶向性强，副作用小的优势，具有光明的临床应用前景。然而如何快速、准确地确定工业产出的质粒药物的生物活性，对控制质粒药物产品的质量具有非常重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出了一种能够客观、准确、快速、可重复性高地确定质粒药物生物活性的方法和装置。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种确定质粒药物具有生物活性的方法，所述质粒药物表达HGF。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将待测质粒药物引入哺乳动物细胞中，所述待测质粒携带表达HGF的核酸分子；(2)在适于HGF表达的条件下，对步骤(1)中所得到的所述哺乳动物细胞进行培养，并收集培养物的上清液；(3)使步骤(2)中所得到的上清液与HUVEC细胞接触，并确定在所述接触前后，所述HUVEC细胞的增殖活性变化；以及(4)基于所述HUVEC细胞的增殖活性变化，确定所述待测质粒药物是否具有生物活性，其中，在所述接触后，所述HUVEC细胞的增殖活性得到显著提高是所述待测质粒药物具有生物活性的指示。本发明实施例的确定表达HGF质粒药物具有生物活性的方法很好地利用了HUVEC细胞自身增殖能力低，在生长因子HGF存在的条件下，其增殖活性变化明显的特点。利用本发明实施例的确定表达HGF质粒药物是否具有生物活性的方法，能够客观、准确、快速、可重复性高地确定表达HGF质粒药物的生物活性。

根据本发明的实施例，上述确定质粒药物是否具有生物活性的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，在步骤(1)中，通过电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法将待测质粒药物引入哺乳动物细胞中，优选脂质体介导法。利用脂质体介导法将测质粒药物引入哺乳动物细胞中，质粒药物的转染效率高，转染后哺乳动物细胞的成活率高，最终对质粒药物是否具有生物活性的确定更加客观和准确。

根据本发明的实施例，所述哺乳动物细胞是CHO细胞，并且在步骤(1)中，所述CHO细胞预先接种于6孔板，所述CHO细胞的接种密度是1*10⁶/孔。在上述接种密度下，利用本发明实施例的确定质粒药物具有生物活性的方法，所得结果更加客观和准确，可重复性更高。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，进行所述培养48h。在上述培养时间下，利用本发明实施例的确定质粒药物具有生物活性的方法，所得结果更加客观和准确，可重复性更高。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述上清液与HUVEC细胞接触之前，预先将所述上清液进行稀释，所述稀释的倍数是4～16倍，优选16倍。发明人经过大量的实验发现，当上清稀释倍数在4～16倍时，HUVEC细胞的增殖活性变化明显，进而最终对质粒药物是否具有生物活性确定的准确度和可重复性显著提高。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述HUVEC细胞预先接种于96孔板并进行培养24h,所述HUVEC细胞的接种密度是5000/孔。发明经过实验发现，在此密度条件下，HUVEC细胞接触到上清后的增殖活性变化明显，进而最终对质粒药物是否具有生物活性确定的准确度和可重复性显著提高。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述HUVEC细胞为10代以内细胞。发明人经过实验发现，HUVEC细胞为10代以内细胞，与上清接触后的增殖反应显著、快速，最终对质粒药物是否具有生物活性确定的准确度和可重复性显著提高。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述接触是在37摄氏度、5％CO₂的条件下进行72h。发明人经过接触条件的筛选实验发现，上清液与HUVEC细胞在37摄氏度、5％CO₂的条件下进行72h的接触，HUVEC细胞的增殖活性变化明显，最终对质粒药物是否具有生物活性确定的准确度和可重复性高。

根据本发明的实施例，所述HUVEC细胞的增殖活性是通过检测HUVEC细胞的ATP响应值确定的。利用通过检测HUVEC细胞的ATP响应值来确定HUVEC细胞的增殖活性，有利于提高检测结果的准确度和可重复性。