[发明专利]一种快速区分AIV、NDV、MG和MS的多重荧光免疫分析方法及试剂

权利要求书

1.一种快速区分AIV、NDV、MG和MS的多重荧光免疫分析的引物，所述引物核苷酸序列如下所示：

引物A1：5’-ATGAGTCTTCTACCCGAGG-3’(SEQ ID NO:1)，

引物A2：5’-TCAGAGGTGACAGGATTG-3’(SEQ ID NO:2)；

引物N1：5’-CTCATCTCAGACAGGGTCAATC-3’(SEQ ID NO:3)，

引物N2：5’-ATGGAGTCACCAAGGGG-3’(SEQ ID NO:4)；

引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’(SEQ ID NO:5)，

引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’(SEQ ID NO:6)；

引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’(SEQ ID NO:7)，

引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’(SEQ ID NO:8)；

所述引物A1和A2、N1和N2、G1和G2、S1和S2这4组引物对中连接的tag序列选自SEQ ID NO:9～12所示的tag序列，且该4组引物对中连接的tag序列互不相同。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：

所述引物A1和A2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物N1和N2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物G1和G2其中一条引物的5’端被生物素化；

所述引物S1和S2其中一条引物的5’端被生物素化。

3.根据利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物A1和A2、N1和N2、G1和G2、S1和S2中未被生物素化的引物的5’端连接有tag序列，所述tag序列能与荧光编码微球中带有的anti-tag序列互补配对。

4.一种快速区分AIV、NDV、MG和MS的多重荧光免疫分析的试剂，其特征在于，该试剂中含有权利要求1～3任一所述引物。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，该试剂中还含有链霉亲和素-藻红蛋白复合物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球。

6.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述荧光编码微球中还含有与引物中tag序列互补配对的anti-tag序列，编码不同荧光色的荧光编码微球中含有的anti-tag序列互不相同。

7.一种快速区分AIV、NDV、MG和MS的多重荧光免疫分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)从样品中提取病毒RNA或/和DNA；

2)以提取的病毒RNA或/和DNA为模板，用权利要求1～3任一所述的引物进行RT-PCR扩增；

3)将上步扩增产物、4种编码不同荧光色的荧光编码微球、链霉亲和素-藻红蛋白进行杂交；

4)杂交结束后，通过Luminex系统对杂交产物进行检测分析，确定其病原的类型；上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2)中RT-PCR扩增的反应体系为：

步骤2)中RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min；94℃预变性15min；94℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述杂交的反应体系和程序为：