[发明专利]一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于适配体夹心荧光淬灭技术检测去甲基睾酮的方法。

背景技术

19-去甲基睾酮是一种将雄性激素(睾酮或者甲基睾酮)经结构修饰后得到的合成甾体激素，具有刺激体内蛋白质合成的增加，减弱氨基酸的分解代谢，促进骨骼生长等功效。在畜禽养殖过程中，人们通过添加19-去甲基睾酮及其他促蛋白同化激素来增加瘦肉产量，提高饲料转化效率。近年来已有研究表明，富集在体内的19-去甲基睾酮残留及其代谢物质会对人体健康造成危害作用：影响人体肝脏功能，损害心血管系统、生殖系统等，造成内分泌机能障碍，此外还有一定致癌性。因此，从1985年开始，欧盟就禁止使用生长促进类药物饲养畜禽，而我国、日本及欧盟等也均规定动物食用组织中不得有甾体激素残留。2004年欧盟对我国畜禽产品提出了18个种类的兽药残留、抗生素检测监控要求，其中明确指出，动物源性食品药物残留中，19-去甲基睾酮不得检出。

激素残留常用的检测方法为液相色谱-质谱法(LC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等仪器检测方法。这些仪器类方法虽然灵敏度高、定性准确，能够确定目标化合物的分子量、分子式，甚至官能团，适合检测19-去甲基睾酮及其代谢物。但是，这些方法普遍成本较高，需要昂贵的试验仪器、专业的技术人员及耗时费力的前处理工作，无法满足高效、简便、经济的快速检测要求。目前，免疫学检测方法以抗体对抗原的特异性识别为基础，凭借抗原和抗体的亲和力高、检测快速、简便、经济实用等优点，成为最主要的一类19-去甲睾酮快速检测方法，主要包括酶联免疫法(ELISA)和免疫检测试纸，这类检测方法通常需要多步洗脱步骤，并且在只有一个可利用抗体的情况下只能建立竞争法检测模式，此外抗原抗体制备不易、生物稳定性差等都是免疫学快速检测方法需要克服的问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种适配体夹心荧光淬灭法检测待测样品中是否含有19-去甲睾酮的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤A：

1)将能结合去甲睾酮的核酸适配体1和能结合去甲睾酮的核酸适配体2与待测样品混匀得到反应体系，反应，得到待测样品反应产物；以不加入待测样品为对照，得到对照反应产物；

所述核酸适配体1和所述核酸适配体2分别标记荧光基团和淬灭基团；

2)检测待测样品反应产物和对照反应产物的荧光强度，根据二者的荧光强度强弱比较，确定待测样品中是否含有19-去甲睾酮。

上述方法中，所述检测待测样品反应产物和对照反应产物的荧光强度，根据二者的荧光强度强弱比较，确定待测样品中是否含有19-去甲睾为如下A或B：

A、若待测样品反应产物的荧光强度小于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中含有或候选含有19-去甲睾酮；若待测样品反应产物的荧光强度大于等于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中不含有或候选不含有19-去甲睾酮；

B、若待测样品反应产物的荧光强度显著小于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中含有或候选含有19-去甲睾酮；若待测样品反应产物的荧光强度不显著小于对照反应产物的荧光强度，则待测样品中不含有或候选不含有19-去甲睾酮。

上述方法中，所述核酸适配体1的3’末端标记淬灭基团，且所述核酸适配体2的5’末端标记荧光基团；

或所述核酸适配体1的5’末端标记淬灭基团，且所述核酸适配体2的3’末端标记荧光基团。

上述方法中，所述淬灭基团为BHQ；所述荧光基团为6FAM。

上述方法中，所述核酸适配体P1的核苷酸序列为序列1；

所述核酸适配体P2的核苷酸序列为序列2。

上述方法中，所述反应体系中，所述核酸适配体P1和所述核酸适配体P2的摩尔比为1:1；

所述反应的条件为避光反应20min；

所述检测的条件为Ex为480nm，Em为520nm。

本发明另一个目的是提供一种适配体夹心荧光淬灭法检测待测样品中19-去甲睾酮含量的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)上述方法中的步骤A，得到待测样品反应产物的荧光强度；

2)重复步骤A，且将步骤A中的待测样品替换为不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液，得到不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液反应产物的荧光强度；以不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液的浓度log作为横坐标，不同浓度的19-去甲睾酮标准品溶液反应产物的荧光强度作为纵坐标制备标准曲线；标准曲线如图2所示。