[发明专利]一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中提取抗生素的工艺，尤其是涉及一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法。

背景技术

多杀菌素(Spinosad),又名刺糖菌素，是由放线菌属中的刺糖多孢菌(Saccharopolyora spinosa)经过有氧发酵产生的胞内次级代谢产物，是一种新型的大环内酯类抗生素，其主要活性成份为spinosyn A(约占85％～90％)和spinosyn D(约占10％～15％)。

多杀菌素是一种新型的具有触杀及摄食毒性的广谱生物杀虫剂，为微生物源生物农药。多杀菌素具有极高的选择性和较低的非靶标毒性,它能有效地毒杀鳞翅目、缨翅目以及双翅目等害虫,并且还可以很好地防治鞘翅目、直翅目中某些吞食叶片的害虫,具有杀虫谱广、毒力高、低残留、非靶标毒性低以及对环境友好等特点。目前，在国内在使用的多杀菌素是由美国陶氏益农公司(Dow Agrosciences Company)生产的、分别用于蔬菜和棉花的虫害防治的菜喜(2.5％多杀菌素悬浮剂)和催杀(48％多杀菌素悬浮剂)。

多杀菌素为浅灰色或白色固体结晶，带有一种类似于轻微陈腐泥土的气味，难溶于水，易溶于甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、正己烷、石油醚等有机溶剂。多杀菌素属非挥发性物质，蒸气压大约为1.3×10^-10Pa。在水溶液中pH值为7.74，对金属和金属离子在28d内相对稳定。

目前，已公布的提取多杀菌素的方法主要有树脂吸附法和溶媒萃取法等方法。但对于胞内产物多杀菌素的提取，基本上通过有机溶剂浸提。

本发明采用复合酶来处理刺糖多孢菌的菌丝体，使产生于菌丝体内的多杀菌素释放至发酵液中，并用草酸调整pH值至4.0～5.0，一方面增加了多杀菌素在发酵液中的溶解度，另一方面有利于发酵液形成大量的絮状悬浮物，便于板框过滤，收集滤清液，不需要采用有机溶剂来浸提菌丝体中的多杀菌素。本发明还采用活性炭柱去除发酵液中含有的大量色素和胶质等杂质，使后续步骤中乙酸乙酯的萃取过程不产生乳化，很容易两相分离，提高了多杀菌素的提取收率和产品纯度。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述已有技术存在的缺陷而提供一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法，克服现有工艺上的成本高、溶剂用量大、环境污染重等缺点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素的方法，采用以下步骤：

(1)发酵液预处理：按刺糖多孢菌发酵液体积0.05～0.15w/v％的量加入复合酶，破坏发酵液中的菌体细胞，搅拌后加入草酸调整pH值为4.0～5.0，发酵液中形成大量的絮状悬浮物，过滤后收集滤清液；

(2)过活性炭柱去除大量色素和胶粘性杂质：将步骤(1)中的滤清液上活性炭柱，收集过柱液，得到富集多杀菌素的水相；

(3)多杀菌素萃取：使用乙酸乙酯作为萃取剂，加入量为水相体积的1/4～1/2，萃取富集多杀菌素水相中的多杀菌素，得到负载有机相；

(4)反萃取：以酒石酸溶液为反萃取剂，加入量为负载有机相体积的0.5～1.5倍进行反萃取，收集反萃取相；

(5)精滤：利用精细过滤器对反萃取相进行精滤，得到高纯精滤液；

(6)析晶：用NaOH溶液调节高纯精滤液的pH值至9～11.5，使多杀菌素以晶体形式析出，得到结晶液；

(7)分离：使用离心机对结晶液进行离心分离，控制离心机的转速为1000～1400rpm，得到多杀菌素湿晶；

(8)干燥：对得到的多杀菌素湿晶进行真空干燥，即得到多杀菌素。

步骤(1)中所述的复合酶由以下重量百分比含量的原料混合得到：溶菌酶0.3～2、纤维素酶3～5、微生物絮凝剂93～96，其中，纤维素酶为复合酶，由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶混合组成，微生物絮凝剂主要成分为蛋白质，其中含有疏水性氨基酸，包括丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸及天冬氨酸。

步骤(1)中控制搅拌转速为20～50rpm，搅拌30～60分钟，反应温度为30～33℃，pH值为4.0～5.0。

步骤(1)中利用板框进行过滤，使用的介质为丙纶滤布，孔径为300～500目，板框进料压力为0～0.6MPa。

步骤(2)中所述的活性炭柱采用木质粉末活性炭，每吨发酵液用量为10～30kg，过柱流速控制在3吨～8吨/小时。