[发明专利]一种单组份TMB显色液及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物体外诊断试剂及其制备方法，尤其是一种TMB显色液及其制备方法。

背景技术

TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)是一种新型安全的色原试剂，作为过氧化物酶的新底物，在酶联免疫吸附检测(ELISA)中获得了广泛应用。底物产生一种可溶性淡蓝色的末端产物，可在370或630nm在分光光度计上读取。其适用于酶联免疫反应中的显色阶段的定量和定性分析。其检验的原理是：当标记在抗体或抗原上的酶与显色液中的TMB、双氧水等反应，加入终止液后溶液由无色变成黄色，黄色深浅反应ELISA体系中抗原抗体结合的多少，从而判断某种抗原或抗体的多少。在通过酶标仪测度吸光值，判断免疫反应的程度。

现有市售的酶联免疫试剂盒所采用TMB显色剂液分为两种，一种为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，由于在使用上易造成操作不方便，且混合后保存时间短等缺点，逐渐被第二种取代；第二种即为单组份TMB，操作方便，但目前市面上所使用的单组份TMB稳定性差，保存时间短，大部分的保存时间在3-6个月，且显色背景高，均一性不好。TMB为脂溶性化合物，难溶于水，且容易在空气环境中被氧化。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种TMB溶解度高、TMB溶液稳定性强、反应终止后结果能稳定保存一段时间、读数更加方便的单组份TMB显色液；同时，本发明还提供了所述单组份TMB显色液的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种单组份TMB显色液，包含TMB，所述TMB显色液还包含L-甲硫氨酸。

TMB在显色反应中为供氢体，反应中除了在相关酶的催化下进行显色反应，容易被空气或溶液中存在的O^2-和OH^-氧化。本申请发明人在此基础上选择使用抗氧化剂阻止TMB的非酶氧化，在众多的抗氧化剂中，经过大量研究及试验发现，当选择L-甲硫氨酸作为TMB的抗氧化剂，不仅能够防止TMB被O^2-和OH^-氧化，而且能够提高TMB溶液的稳定性及检测的灵敏度。

作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.02～1g/L。作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.1～0.3g/L。

作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含吐温80和羟丙基-β-环糊精。

本发明的单组份TMB显色液，通过引入吐温-80和羟丙基-β-环糊精助溶TMB，使本发明的单组份TMB显色液形成稳定的水溶液体系，同时羟丙基-β-环糊精有1个“内疏水、外亲水”的特殊立体环状结构，能够对脂溶性的TMB进行包合，从而提高TMB分子的水溶性、稳定性和抗氧化、抗光解能力，配合其它组分可使本发明在2-8℃下，能保存24个月。同时羟丙基-β-环糊精作为稳定剂，能使TMB显色液在强酸终止反应后，信号稳定时间更长。

作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为1～15g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2～9g/L。作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为4～10g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5～5g/L。

作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢；所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5～40ml/L；所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0.1mol/L；所述柠檬酸在TMB显色液中的摩尔浓度为0.03-0.05mol/L；所述过氧化氢在TMB显色液中的体积浓度为1-1.25ml/L；所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-1g/L。

二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为"万能溶剂"。采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为基础溶液，来溶解各物质成分。TMB在过氧化氢的存在下，被氧化成最终产物。