[发明专利]果糖和二硫苏糖醇联合预处理在骨髓间充质干细胞冻存中的应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞冷冻保存技术领域，涉及果糖和二硫苏糖醇联合预处理在骨髓间充质干细胞冻存中的应用，一种骨髓间充质干细胞的冻存预处理试剂，以及一种骨髓间充质干细胞的冻存方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一类多能干细胞，不仅具有自我更新能力，而且具有多向分化潜能，在损伤组织修复、再生医学中扮演着十分重要的角色，已成为一种理想的基因/细胞治疗的种子细胞，在临床上显示出十分诱人的应用前景。

为广泛开展MSCs的研究及临床应用，需要长期保存MSCs。深低温冷冻保存是实现细胞长期保存的最有效方法，但细胞的冷冻保存或多或少对细胞有所损伤。现有的MSC冻存技术常常导致MSCs活性降低、分化能力下降甚至多能性丧失，严重影响其研究/应用。因此，如何在体外将MSCs有效冻存，减少其冷冻损伤，最大限度提高冷冻MSCs复苏后的细胞活性，使其保持良好的增殖和分化能力，是目前MSCs研究/应用过程中面临的重要问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种MSCs冻存方法，可以在体外将MSCs有效冻存，减少其冷冻损伤，提高冷冻MSCs复苏后的细胞活性，使其保持良好的增殖和分化能力。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.果糖和二硫苏糖醇（DTT）联合预处理在MSCs冻存中的应用。

2.MSCs的冻存预处理试剂，由200μM果糖和500μMDTT组成。

上述果糖浓度和DTT浓度是通过实验筛选出的最佳预处理浓度。

进一步，溶剂为添加10vol%胎牛血清的DMEM培养基。

3.MSCs的冻存方法，包括以下步骤：取生长良好的MSCs，用添加200μM果糖、500μMDTT和10vol%胎牛血清的DMEM培养基在温度为37℃、空气中二氧化碳体积分数为5%的条件下预处理1小时，再离心收集细胞，悬浮于添加10vol%二甲基亚砜（DMSO）和20vol%胎牛血清的DMEM培养基中，混匀，分装，逐级冷冻后转入液氮中长期保存。

本发明的有益效果在于：本发明将MSCs经果糖和二硫苏糖醇联合预处理后再冻存，经实验证实，冻存MSCs复苏后在形态上与未经预处理的MSCs无明显差别，但预处理明显提高了冷冻MSCs复苏后的细胞活性，并且其多向分化潜能未受任何影响，保持了良好的增殖和分化能力。

附图说明

图1为果糖和DTT联合预处理对冻存MSCs复苏后形态的影响（×40）。

图2为果糖和DTT联合预处理对冻存MSCs复苏后细胞活性的影响。

图3为果糖和DTT联合预处理对冻存MSCs复苏后多能性基因表达的影响，其中A为Nanog基因相对表达量，B为OCT4基因相对表达量，C为Sox2基因相对表达量。

图4为果糖和二硫苏糖醇联合预处理对冻存MSCs复苏后碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。

图5为果糖和二硫苏糖醇联合预处理对冻存MSCs复苏后钙节点形成的影响。

图6为果糖和二硫苏糖醇联合预处理对冻存MSCs复苏后脂肪颗粒形成的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

MSCs的分离培养：

取150-200gSD大鼠，断颈法处死大鼠，酒精浸泡大鼠10min，提取大鼠后肢股骨和胫骨，去除周围肌肉组织，用添加10vol%胎牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔3-5次，轻轻吹打培养基将细胞吹散，吸取5mL分别接种于2个25cm²的细胞培养瓶，初次24h更换培养液一次，以后每2天换液一次，待细胞生长融合、铺满培养瓶底壁的80~90%时进行传代培养。

MSCs的预处理和冻存：