[发明专利]一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用

说明书

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用。利用软件预测三基因的B细胞结合位点的序列，通过Linker将结核分枝杆菌Rv0222，Rv2657c和Rv1509三个基因的B细胞结合位点序列串联，获得融合基因，其序列如SEQ ID NO：11所示。该融合基因包含在原核表达质粒中，含有该重组质粒的大肠杆菌保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2016159。本发明还公开了该融合基因编码蛋白在制备检测活动性肺结核血清诊断试剂盒中作为诊断标识抗原蛋白的应用。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用。

背景技术

肺结核是严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，主要由结核分枝杆菌引起，是我国重点控制的主要疾病之一。全球每年死于结核病的人口大约300万，而我国肺结核发病率呈现逐年上升趋势。目前典型肺结核的诊断主要通过对临床表现的观察、痰查结核菌、胸部影像学、支气管镜检查等作出判断，一旦确诊后有相对成熟有效的治疗方案，而且多数患者可以治愈；但一些非典型的肺结核诊断存在难度，尤其是老年患者以及合并糖尿病、艾滋病等疾病的患者，其临床表现高度可变，如无症状、非特异性症状、轻微呼吸道症状以及呼吸衰竭，可能会导致误诊、漏诊，从而严重影响疾病的预后，甚至导致患者死亡。

目前肺结核的检测仍然依靠痰涂片检查、痰培养结合影像学作为主要诊断手段。然而痰培养的最大缺陷是耗时较长，容易延误治疗时机。因此开发简单快速、特异性好、灵敏度高的血清免疫学诊断试剂是近年来结核病诊断研究的重点。目前市面上的结核杆菌血清学检测试剂以基于单一的结核杆菌重组抗原为主。大量文献和临床资料表明，由于结核患者的抗体反应存在异质性，单一抗原用于血清学诊断存在敏感性低而假阳性率较高的缺点。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供涉及一种结核分枝杆菌融合基因蛋白及其应用。本发明利用结核分枝杆菌RD区蛋白对结核病人的血清抗体进行筛选，提供一种与检测肺外结核患者(EPTB)，活动性结核(PTB)，潜伏性结核(LTBI)和健康对照者血清的生物标识蛋白，该标识蛋白可用于肺外结核患者，活动性结核，潜伏性结核患者的血清学诊断，建立结核患者Rv0222，Rv2657c，Rv1509三基因B细胞结合位点融合蛋白的血清抗体检测方法，为肺活动性肺结核的及时诊断和治疗提供技术支持。

结核分枝杆菌单一抗原以及融合抗原进行ELISA检测对比，发现融合蛋白抗原能够提高抗体血清学检测的特异性及敏感度。本发明分别自结核分枝杆菌标准菌株H37Rv(武汉大学刘君炎教授馈赠)扩增Rv0222，Rv2657cb，Rv1509c基因片段并依次与原核表达载体连接形成融合基因，含有融合基因的质粒在大肠杆菌中成功表达并得到纯化，为结核病的临床诊断提供一组新的候选抗原。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过基因工程的方法人工了包含结核分枝杆菌本基因的B细胞结合位点的融合基因Rv0222-Rv2657c-Rv1509，利用Protean(DNAStar,Madison,WI)软件分别预测三基因的B细胞受体位点，它们的核苷酸组合序列分别为Rv0222：p1-p110；Rv1509：p90-210；Rv2657c：p50-80，通过Linker将结核分枝杆菌Rv0222基因，Rv2657c基因和Rv1509基因B细胞受体位点序列串联，获得融合基因Rv0222-Rv2657c-Rv1509，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。