[发明专利]皮肤色素沉着体外细胞模型及其制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及色素沉着模型及其制作方法技术领域，是一种皮肤色素沉着体外细胞模型及其制作方法。

背景技术

黑素是决定人体肤色最重要的因素，它以酪氨酸（Tyrosine）为底物，在酪氨酸酶（TYR）的作用下合成黑素。酪氨酸酶关键基因如TYR、TRP-1、TRP-2等参与和影响黑素合成的调控。这三种基因都有一个跨膜区，尽管有相似的结构和特征，但却通过不同的基因表达而拥有独特的酶活性。酪氨酸酶（TYR）在黑素的合成进程中至关重要，它是黑色素细胞中催化黑素生成的主要限速酶。TRP-1和TRP-2也参与黑素生成的酶过程，同时对维持酪氨酸酶在黑色素体膜上的稳定和阻止未成熟的黑色素细胞死亡具有重要影响。而MITF是黑色素细胞重要的转录因子之一，在皮肤黑素生成过程中，MITF作为分子开关，可转录调控TYR、TRP-l和TRP-2（黎钊,等.医学研究杂志,2013,42(3):58-62）。正常黑素的合成和沉着，具有保护皮肤、抵御紫外线辐射和防止机体内部组织过热等功效。而任一环节的缺陷或受某一因素的影响将会引起黑素合成或运输过程的紊乱，产生皮肤黑素沉着过多、过少或缺乏等异常改变，从而导致一系列色素代谢障碍性疾病的发生。此类疾病易诊难治，给患者的身体和心理带来巨大的痛苦和伤害。

对色素沉着性疾病和药物的研究离不开好的实验模型，由于黑色素瘤细胞株较易获得和培养简便，故目前研究多以小鼠或人黑色素瘤细胞作为皮肤色素沉着疾病的模型载体，然而，人体90%以上的黑素是在人皮肤黑色素细胞中合成，采用人黑色素瘤细胞作为皮肤色素沉着疾病的模型载体时，该模型与人皮肤的结构、性状和功能具有一定的差异，因此不能真实反映人体皮肤的正常生理状况，从而对色素沉着性疾病和药物的研究具有一定的偏差。

另外，正常的紫外线照射可促进黑色素细胞黑素合成的增多，黑素能够吸收一定量的紫外线，避免或减少机体染色体受损，但是过量的紫外线照射会损伤机体细胞，导致皮肤色素沉着性疾病的发生，并可能诱发皮肤癌。太阳光紫外线波段主要分为四个部分：400nm至320nm为长波紫外线（UVA波段）、320nm至280nm为中波紫外线（UVB波段）、280nm至200nm为短波紫外线（UVC波段）、200nm至100nm为真空紫外线（UVD波段），其中，UVB主要作用于皮肤表皮层及真皮浅层，对人体的生理作用较强，易导致皮肤脱皮、红斑、粗糙、皱纹及色素沉着的发生。

发明内容

本发明提供了一种皮肤色素沉着体外细胞模型及其制作方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有皮肤色素沉着细胞模型存在的与真实的患有色素沉着性疾病的人皮肤的生理情况相差较大的问题；本发明首次采用人皮肤黑色素细胞构建本发明所述的皮肤色素沉着体外细胞模型。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种皮肤色素沉着体外细胞模型，按下述步骤得到：第一步，将外科手术环切得到的幼儿新鲜包皮采用含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液进行清洗，然后将清洗后的幼儿新鲜包皮在无菌的条件下去除皮下脂肪和结缔组织，接着将去除皮下脂肪和结缔组织的幼儿新鲜包皮采用裂解酶分离表皮层和真皮层后得到混悬液，采用吸头反复吹打混悬液，再将血清加入混悬液中，经过终止消化后得到表皮组织混悬液；第二步，将表皮组织混悬液依序经过过滤和离心后得到人皮肤黑色素细胞；第三步，将人皮肤黑色素细胞依序经过UVB辐射和48小时至72小时的细胞培养后得到皮肤色素沉着体外细胞模型，其中，在UVB辐射过程中，照射强度为0.1J/cm²至0.4J/cm²，照射的次数为2次至3次，照射的时间间隔为12小时至24小时。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述第三步中，在UVB辐射过程中，照射强度为0.3J/cm²，照射的次数为2次，照射的时间间隔为12小时。

上述第一步中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.010mol/L至0.015mol/L，在磷酸盐缓冲液中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为100μg/mL。

上述第一步中，裂解酶分离的温度为37℃，采用0.25%胰酶进行分离。