[发明专利]狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用

权利要求书

1.含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6，其特征在于：所述先导RNA为先导RNA1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述先导RNA对应的双链DNA序列插入到重组真核表达载体AAV-U6的BbsI酶切位点之间；其中，所述重组真核表达载体AAV-U6是在真核表达载体AAV的NotI酶切位点之间插入U6-BbsI-CMV-mcherry片段得到的，U6-BbsI-CMV-mcherry片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

2.根据权利要求1所述含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6，其特征在于：所述重组真核表达载体AAV-U6的构建方法，包括以下步骤：

1)PCR扩增U6启动子：以PX335质粒为模板设计引物对，同时下游引物的末端带有与CAGEnhancer序列互补的一段同源臂，其中，引物对为：

U6-F-NotI：

U6-R-BbsI：

进行PCR扩增，纯化得到NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

2)PCR扩增mcherry表达盒：以pmCherry为模板设计引物对，mCherry核苷酸序列如SEQID No.10所示，其中，上游引物带有与NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT序列末端相同的一段同源臂，下游引物带有NotI酶切位点；使用的引物序列如下：

CMV-CAG-F-BbsI：

CMV-terminator-R-NotI：

PCR扩增纯化得到CAG-CMV-mcherry-Terminator-NotI片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.11所示；

3)融合PCR扩增U6-BbsI-CMV-mcherry；

以NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段和CAG-CMV-mcherry-Terminator-NotI片段作为模板进行融合PCR；其中，引物对为：

U6-F-NotI：

CMV-terminator-R-NotI：

PCR扩增纯化得到U6-BbsI-CMV-mcherry片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

4)酶切：NotI酶切载体pAAV和片段U6-BbsI-CMV-mcherry，酶切后纯化线性化的载体和片段；

5)连接：用T4连接酶连接线性化的载体和片段，并转化大肠杆菌感受态Stbl3，挑取克隆并提质粒测序，鉴定正确即得到重组真核表达载体AAV-U6。

3.根据权利要求2所述含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6，其特征在于：所述步骤1)中，PCR反应体系如下：

PCR的条件如下：

；

所述步骤2)中，PCR反应体系如下：

CMV-CAG-F-BbsI：

CMV-terminator-R-NotI：

PCR的条件如下：

；

所述步骤3)中，PCR反应体系如下：

PCR的条件如下：

4.一种权利要求1所述含有先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6在制备治疗和预防狂犬病的药品中的应用。