[发明专利]转基因玉米BT176核酸标准样品及其制备方法

权利要求书

1.一种转基因玉米BT176核酸标准样品，其特征在于：所述转基因玉米BT176核酸标准 样品包含转基因玉米BT176品系特异性基因片段和玉米内源zein基因片段，具体序列为：

转基因玉米BT176品系特异性基因片段序列:

ggccgtgaacgagctgttnnnnnnnagcaaccagatcggccgacaccnnnnnnnnnntta

gaaaacatgtaggcttcttccc；

玉米内源zein基因片段序列：

cgtcgtttcccatctcttcctccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnaatcagggctcattttc

tcgctcctcannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngactg

agggtctcggagtgg。

2.根据权利要求1所述的一种转基因玉米BT176核酸标准样品，其特征在于：所述转基因 玉米BT176品系特异性基因片段为玉米基因组DNA与BT176品系特异基因之间的边界序列。

3.一种根据权利要求1所述的转基因玉米BT176核酸标准样品的制备方法，其特征在 于：包括以下步骤：

第一步：总DNA提取：

取转基因玉米BT176品系种子进行种植，并在玉米成熟后收取转基因玉米作为原料，采 用TaKaRa公司的DNA提取试剂盒（货号D9093）进行DNA提取；

第二步：特异性PCR扩增：

特异性PCR扩增的25μL反应体系：10×PCRBuffer2μL，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，Ex Taq（5U/μL）0.2μL，引物（10pmol/μL）各1μL，模板DNA（0.3-6μg/μL）2μL，用无菌水补充至25 μL；

异性PCR扩增的反应条件：94℃预变性3.0min；94℃变性0.4min，55℃退火1min，72℃延 伸1min，35个循环；72℃5min；4℃保存，引物及探针序列见表1：

表1引物及探针序列

；

第三步：PCR扩增产物回收纯化：

PCR扩增产物回收纯化采用PCR纯化试剂盒（DV805A）（TaKaRaAgaroseGelDNA PurificationKitVer.2.0试剂盒（DV805A））进行；

第四步：质粒制备：

将PCR扩增后获得的转基因玉米BT176品系特异性基因、玉米内源zein基因的目的片段 回收后，连接至pMD19-TVector载体，通过筛选鉴定获得具有插入片段的克隆，质粒标准样 品再经其他有资质的测序公司进行测序比对确认,具体步骤如下:

（1）选取载体与连接

选取宝生物工程（大连）有限公司生产的pMD19-TVector载体，将T载体与插入目标基 因片段大小按如下比例连接：

连接体系为：

高效连接液（LigationMix宝生物工程（大连）有限公司)2μL

插入基因片段（Insertfragment）2μL

T载体1μL

蒸馏水15μL

4℃，连接过夜；

（2）制备JM109感受态细胞

挑一个感受态细胞的单菌落到10mL不含有抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇培养 3h，使其浓度达到OD₆₀₀=0.4左右，将培养好的感受态细胞分装在1.5mL经高压灭菌的EP管 中，冰浴10min，之后4℃，4100rpm离心10min，弃净培养基，用750mL预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重悬细胞，4℃，4100rpm离心10min，弃净CaCl₂溶液，200μL预冷的0.1mol/LCaCl₂重悬 细胞，4℃存放一周内使用，或加入10％灭菌甘油，－70℃存放待用；

（3）热转化

将（1）中的连接液20μL加入至100μLJM109感受态细胞中，放置冰中30min；42℃加热 45s后，再在冰中放置2-5min；加入900μLSOC培养基，转入15mL小管中，37℃振荡培养60 min；以100μL和200μL两个梯度涂SOC平板，37℃过夜培养，形成单菌落，计数白色、蓝色菌 落；

（4）阳性克隆的筛选

用灭菌牙签挑取白色菌落，进行PCR筛选，电泳确定插入片段大小，挑选已经插入正确 片段的菌落植菌，4mLTB(Amp)培养，37℃过夜；

（5）质粒回收

应用质粒回收纯化试剂盒（TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0 （货号DV801A））回收质粒DNA，挑选阳性克隆质粒DNA进行DNA双向测序，确保构建的质粒DNA 与预期DNA序列一致；

（6）目标分子DNA线性化处理

将上述质粒，即目标分子DNA用Hind-Ⅲ限制酶进行线性化处理，经PCl₃抽提、乙醇精制， 取1μL进行电泳确认，即得转基因玉米BT176核酸标准样品。