[发明专利]一种短杆菌及从短杆菌发酵液中分离提纯延胡索酸酶的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种短杆菌及从短杆菌发酵液中分离提纯延胡索酸酶的方法。

背景技术：

延胡索酸酶(Fumarase)又名苹果酸裂合酶、延胡索酸水化酶或富马酸酶， 氧化还原酶(E.C.4.2.1.2),是三羧酸循环(TCA循环)中的一个关键性酶，能 催化延胡索酸通过加水生成产率和光学纯度都非常高的L-苹果酸，且反应机制 较为单一，是一种非常具有商业价值的酶。工业生产中酶一般以粗酶的形式，然 而一定纯度的酶不仅能够提高催化效率，降低能耗，同时减少因杂酶的影响而产 生的副产物，影响产品纯度。

常见的延胡索酸酶蛋白纯化方法有盐析沉淀法、疏水层析、离子交换层析和 凝胶过滤等。但传统方法分离回收率低，样品处理少，杂质多，产品纯度低。

发明内容：

本发明的目的是提供一种短杆菌，本发明的另一目的是针对现有技术提取延 胡索酸酶纯度低、回收率低的问题的问题，而提供了一种简单易行，成本低，纯 度低，易于大规模生产的一种从短杆菌发酵液中分离提纯延胡索酸酶的方法。

本发明的技术方案为：一种短杆菌，菌种的拉丁学名是Brevibacteriumsp.， 参据的微生物：NJWGY2133，保藏日期为2008年5月26日，保藏中心登记入 册编号为CGMCCNo.2520。

本发明还提供了从上述的短杆菌的发酵液中分离提纯延胡索酸酶的方法，具 体步骤如下：

(1)发酵培养：将短杆菌菌株接种于肉汤琼脂培养基后培养；挑取1环单菌落 接种至种子培养基，控制装体积液量15％～25％，温度28～37℃，转速180～220rpm， 置于摇床中培养20～28h得种子液；以2％～10％的体积接种量接种于发酵产酶培 养基中，发酵罐体积装液量为20～40％，控制温度为25～37℃，搅拌速率220～400 rpm，pH控制在7.0～7.5，培养24～32h得发酵液；

(2)粗酶液的制备：将步骤(1)所得短杆菌发酵液离心，过滤制得菌丝体；将 菌体细胞加入去离子水中，制得质量浓度为35～45％的细胞悬浮液；用KQ-1001 型超声机超声破碎，得含有延胡索酸酶的混合物；

(3)双水相萃取剂的制备：向无机盐水溶液中添加聚乙二醇，并不断搅拌混合 均匀，制得聚乙二醇-无机盐双水相体系溶液；其中双水相体系中无机盐的质量 百分比为5～15％，聚乙二醇的质量百分比为15～20％；

(4)双水相萃取：将步骤(2)得到的粗酶液调节pH至8.0～8.5，加入步骤(3) 中聚乙二醇-无机盐双水相体系溶液，双水相体系溶液与粗酶液的体积比为1： (1.5～2.0)，震荡萃取；静止待分层后，分别得无机盐下相溶液和含有延胡索酸 酶的聚乙二醇上相溶液；

(5)二次萃取：将步骤(4)制得的聚乙二醇上相溶液调节pH至6.5～7.0，加入 无机盐，使无机盐在总体系中的质量百分比为2～4％；震荡萃取，静止待分层后， 分别得含有延胡索酸酶的无机盐下相溶液和聚乙二醇上相溶液；

(6)将步骤(5)制得的含有延胡索酸酶的无机盐下相溶液，透析除盐，冷冻干 燥，制得延胡索酸酶。

优选步骤(1)中种子培养基组分为：葡萄糖15～20g/L，酵母浸粉1.0～5.0g/L， 玉米浆20～35g/L，MgSO₄·7H₂O0.3～0.7g/L，控制pH7.0～7.5；

优选步骤(1)中发酵培养基包括下述组分：葡萄糖15～20g/L，酵母浸粉 1.0～5.0g/L，玉米浆20～35g/L，MgSO₄·7H₂O0.3～0.7g/L，氯化钠2～5g/L，KH₂PO₄2～4g/L。

优选步骤(2)中离心转速为6000～8000r/min，离心时间为15～25min。

优选步骤(3)、(4)和(5)中的聚乙二醇分子量均为1000、1500或2000 任意一种；无机盐选自硫酸镁、硫酸钠、硫酸铵、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾任意 一种。

优选步骤(4)和(5)中的静置分相时间均为20～40min。

优选步骤(6)中透析选用分子量8000～10000Da的透析袋。

上述将短杆菌菌株接种于肉汤琼脂培养基培养采用常规方法培养。

本发明中延胡索酸酶的活力测定方法为：