[发明专利]DNA条形码制备方法及草莓疫霉红心病菌DNA条形码

说明书

本申请公开了一种DNA条形码制备方法及草莓疫霉红心病菌DNA条形码。本申请的制备方法，包括用高通量测序技术对靶标菌株基因组DNA进行测序，并对测序结果进行生物信息学分析，采用系统进化树分析基因组DNA中各基因片段进化关系，获得靶标菌株与同属菌株的相似度大于或等于95％、小于100％，片段不大于1000bp的单拷贝基因片段，对单拷贝基因片段进行遗传距离分析，能真实反映亲缘关系的即靶标菌株DNA条形码。本申请的制备方法，利用高通量测序技术对基因组DNA进行全面分析，并用系统进化树和遗传距离分析，获得DNA条形码；为DNA条形码制备提供了一种简单、有效途径；获得的DNA条形码能最有效表征靶标菌株。

技术领域

本申请涉及DNA检测领域，特别是涉及一种DNA条形码的制备方法及草莓疫霉红心病菌的DNA条形码。

背景技术

疫霉属包含100余个种，是最主要的植物病原真菌。草莓疫霉红心病菌Phytophthora fragariae var.fragariae(以下简写为P.fragariae)，是引起草莓属植物红心病的病原菌，其寄主包括草莓属和部分悬钩子属植物，例如罗甘莓和黑莓等，引起的症状有植株矮小、叶片和叶柄萎缩、根茎红心甚至整株植株死亡。游动孢子是它们侵染植物主要的传播途径。不能通过空气传播，但孢子可以在土壤和植物材料上存活很久，通过排水、灌溉进行扩散和传播。一旦感染，可以在数年内蔓延至整个果园，严重影响了水果生长。在欧盟、美国和中国等都被列为检疫性有害生物。

草莓疫霉红心病菌是疫霉属中的重要植物病原菌，对农作物危害巨大。目前对两者的检测方法主要还是传统的形态学检测。因此，亟需一种简单、快速、有效地区分草莓疫霉红心病菌的检测或鉴定手段。

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异、易扩增且相对较短的DNA片段。目前，纵观动物、植物、微生物等的DNA条形码的制备思路和方法，绝大多数都是以常见的ITS片段、线粒体色素氧化酶基因Ⅰ、核糖体大亚基、核糖体小亚基、RNA酶亚基Ⅱ、翻译延长因子、线粒体小亚基操纵子、β-维管束蛋白、肌动蛋白、几丁质合成酶基因、钙调蛋白、热激蛋白90等DNA片段作为候选片段，其对物种区分鉴定都有一定的有限性，例如种内、种间差异不明显，没有明显的条码间隔，近似种区分不开，检疫性物种与非检疫性物种无法区分等。基因组DNA是一个庞大的数据库，从理论上来说，其应该具有大量的可以代表物种，且符合要求的DNA条形码；但是，目前暂没有相关的研究和报道。对于草莓疫霉红心病菌来说，目前也还没有其DNA条形码的相关研究和报道。因此，为了进一步统一和规范草莓疫霉红心病菌的检测和鉴定，亟需对草莓疫霉红心病菌的DNA条形码进行研究和开发。

发明内容

本申请的目的是提供一种DNA条形码的制备方法，以及所制备的草莓疫霉红心病菌的DNA条形码。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种DNA条形码的制备方法，包括采用高通量测序技术对靶标菌株的基因组DNA进行测序，并对测序结果进行生物信息学分析，然后采用系统进化树分析基因组DNA中各个基因片段的进化关系，获得靶标菌株与同属其它菌株的相似度大于或等于95％、而小于100％，并且片段不大于1000bp的单拷贝基因片段，对所述单拷贝基因片段进行遗传距离分析，其中能够真实反映亲缘关系的单拷贝基因片段即所述靶标菌株的DNA条形码。

需要说明的是，本申请的关键在于，有效的利用高通量测序技术，对基因组DNA进行全面的分析，并采用系统进化树分析，最后利用遗传距离分析获得DNA条形码。采用本申请的制备方法获得的DNA条形码，能够有效的表征靶标菌株，为靶标菌株的DNA条形码制备提供了一种最有效的解决方案。本申请中，能够真实反映亲缘关系的单拷贝基因片段是指，采用该单拷贝基因片段进行进化关系分析时，其与同属其它种之间的遗传距离更近，属于同一分支，而与其它属的菌株之间的遗传距离更远，属于不同分支，则判定该单拷贝基因片段能够真实反映亲缘关系。

优选的，生物信息学分析包括基因组拼接和基因注释。