[发明专利]一种新型隐球菌荚膜多糖GXM的制备方法

权利要求书

1.一种新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱的制备方法，其特 征在于，包括如下步骤：

(1)将新型隐球菌荚膜多糖GXM单克隆抗体溶于溶液中，并与亲和 层析基质混合成匀浆；

(2)用交联缓冲液洗涤步骤(1)得到的匀浆，并离心，得到抗体与亲 和层析基质的混合物；

(3)用交联缓冲液重悬步骤(2)得到的抗体与亲和层析基质的混合物， 向得到的混悬液中加入双功能结合剂，室温孵育20-40分钟，并混匀，液固 分离，得到亲和层析基质-抗体交联复合物；

(4)用封闭溶液洗涤步骤(3)得到的亲和层析基质-抗体交联复合物；

(5)将步骤(4)得到的亲和层析基质-抗体交联复合物重悬于封闭溶 液中，室温孵育1.5-2.5小时，混匀；

(6)装柱：将步骤(5)得到的亲和层析基质-抗体交联复合物填充入 层析柱中，制得新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱。

2.如权利要求1所述的新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱的 制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的亲和层析基质选自蛋白A微珠、 蛋白G微珠、活性微珠，优选蛋白A微珠；

和/或，步骤(1)中所述的溶液选自碳酸盐缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液；

步骤(1)中亲和层析基质和溶液的比例为：每10mL溶液中加入 0.5-2.0mL亲和层析基质，亲和层析基质与抗体的比例为：每1mL亲和层析 基质结合1-4mg单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱的 制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的交联缓冲液为0.1-0.3mol/L的 pH8.0-9.5的硼酸钠溶液，用量为5-15倍亲和层析基质体积；

和/或，步骤(3)中所述交联缓冲液为0.1-0.3mol/L的pH8.3-9.5的硼酸 钠溶液，用量为5-15倍亲和层析基质体积。

4.如权利要求1所述的新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱的 制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的双功能结合剂选自二甲基庚二酸 酯、羰基二咪唑、溴化氰、羟基丁二酰亚胺、乙酰基碘，优选二甲基庚二酸 酯，用量为使其在混悬液中的终浓度为15-25mmol/L。

5.如权利要求1所述的新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱的 制备方法，其特征在于，步骤(4)和(5)中所述的封闭溶液选自乙醇胺、 氨基乙烷溶液，优选为乙醇胺溶液，进一步优选为浓度为0.1-0.25mol/L，pH 值为7.5-8.5的乙醇胺溶液。

6.一种新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱，其特征在于，所 述的新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱由权利要求1-5任一项所述 的新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱的制备方法制备得到。

7.一种新型隐球菌荚膜多糖GXM的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤：

(1)新型隐球菌荚膜多糖GXM的提取；

(2)利用权利要求6所述的新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析 柱进行新型隐球菌荚膜多糖GXM粗提物的纯化。

8.如权利要求7所述的新型隐球菌荚膜多糖GXM的制备方法，其特 征在于，所述的新型隐球菌荚膜多糖GXM的提取，包括如下步骤：

(1)培养新型隐球菌，至菌浓度达到对数期后期；

(2)将菌液高压灭菌，离心除去菌体，保留上清液；

(3)向上清液中边搅拌边加入醋酸钙粉末使醋酸钙在上清液中的终浓 度达到2-8％，然后加冰醋酸调pH至4.6-5.2；

(4)向步骤(3)得到的溶液中加入90-98％的乙醇，4℃静置过夜，离 心，弃去上清，干燥沉淀，得到新型隐球菌荚膜多糖GXM的粗提物。