[发明专利]一种小电珠蛋白酶解反应器的制备方法及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属蛋白质分析技术领域，具体涉及一种小电珠蛋白酶解反应器及其制备方 法。

背景技术

相对于基因组学，蛋白组学可以在更深层次对生物体进行研究，解决基因组学不 能回答的问题，目前已经成为化学生物学领域发展最快的研究领域之一[1]。蛋白组学最重 要的任务之一就是建立广泛生物来源的大量蛋白质的快速高效鉴定技术，肽谱分析是蛋白 组研究策略中通常采用的方法。通常，蛋白被酶解成多肽，然后用质谱分析酶解液中的多 肽，获得肽质量指纹图谱，与蛋白质分析数据库比对后可对蛋白进行鉴定。常规溶液酶解需 要时间为12-16小时，耗时较长，不适合蛋白大批量分析和鉴定。而且溶液酶解会导致蛋白 酶的自我分解，产生干扰多肽片段，故建立高效的蛋白酶解新技术对基于质谱的肽谱分析 具有十分重要的意义[2,3]。

最近的研究主要集中在将蛋白酶固定在不同的基体表面以提高酶解效率[3~6]， 酶解时间可显缩短到几分钟，而酶解结果与传统溶液酶解结果相当。采用固定化酶技术来 酶解和鉴定蛋白效率高，可显著提高酶的稳定性，最大限度地降低酶的自我分解，此外，固 定的蛋白酶可重复使用。通常蛋白酶（主要是胰蛋白酶）被固定在芯片、毛细管和磁性纳米 颗粒表面，然后与蛋白溶液作用进行酶解[3~6]，酶解时间可大幅缩短。

目前，各种电磁波也被用于促进溶液中的蛋白酶解[7,8]。电磁波是由同相且互相 垂直的电场与磁场在空间中衍生发射的震荡粒子波，是以波动的形式传播的电磁场，电磁 波是能量的一种重要形式，根据波长电磁波可分为无线电波、微波、红外线、可见光、紫外 线、X-射线和伽马射线等，其中微波已被广泛用于促进蛋白溶液酶解[8]。由于溶液酶解使 用的蛋白酶直接与蛋白溶液混合，酶不能重复使用。此外，蛋白酶的自降解也会产生干扰多 肽片段。于是，建立基于固定化酶的蛋白快速酶解新技术具有十分重要的实际意义。小电珠 通常作为手电筒和仪器电源指示灯的光源，主要由玻璃灯泡、灯丝和金属底座等构成，灯泡 内抽成真空后填充少量惰性气体以防止钨灯丝的蒸发和氧化。小电珠属白炽灯，是热辐射 光源，具有连续的光谱能量分布，当电流通过钨灯丝时，灯丝被加热到很高的温度，释放出 以红外线为主的电磁波。但其仅将15%左右的电能转化为产生可见光，其余约75%的电能被 转换为红外线辐射到环境中去[9~10]。于是，我们想到将胰蛋白酶等蛋白酶酶固定到小电 珠玻璃灯泡表面，利用小电珠发出的红外线作为能量来源加速灯泡表面的蛋白酶解。

本项目将蛋白酶通过共价键固定在小电珠灯泡外的壳聚糖涂层表面，制备用于红 外辅助蛋白高效酶解的反应器。小灯珠不仅是固定蛋白酶的载体，还可产生红外线。经文献 检索，未发现有基于小电珠的蛋白酶解反应器的报道。该反应器已与基质辅助激光解吸电 离飞行时间质谱联用，成功用于几种蛋白和人血清的酶解。由于酶通过共价键固定，其自身 酶解被抑制，故可使用较大的酶量，使酶解效率大幅提高。该反应器可将蛋白质的酶解时间 从传统的溶液酶解的12小时以上大幅度降低到5分钟，大大节约了酶解时间，提高了工作效 率。本发明提出的小电珠蛋白酶解反应器具有结构简单、成本低廉、制作简便、操作简便、酶 解效率高和样品用量少等优点，可为蛋白组学中蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技 术手段。

参考文献

[1]P.Kahn,Science270（1995）369~370.

[3]W.Qu,H.Bao,L.Y.Zhang,G.Chen,Chem.Eur.J.18（2012）15746-15752.

[2]G.W.Slysz,D.F.Lewis,D.C.Schriemer,J.Proteome.Res.5（2006）1959– 1966.

[3]S.Wang,Z.Chen,P.Y.Yang,G.Chen,Proteomics8（2008）1785–1788.

[4]J.Chen,Z.Y.Yu,L.Y.Zhang,G.Chen,Curr.Chem.Biol.3（2009）291– 301.

[5]H.Z.Fan,F.N.Yao,S.Y.Xu,G.Chen,Talanta.117（2013）119–126.

[6]S.Lin,G.P.Yao,D.W.Qi,Y.Li,C.H.Deng,P.Y.Yang,X.M.Zhang, Anal.Chem.80（2008）3655–3665.