[发明专利]一种发酵生产4-Acetylantroquinonol B的方法

权利要求书

1.一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，包括如下步骤:（1）菌种的扩大培养：以挖块接种将牛樟芝菌（Antrodia camphorata）接种至新的固体培养基中进行菌种的扩大培养，待固体培养基中形成新的牛樟芝菌落；所述牛樟芝菌为Antrodiacamphorata BCRC 35396菌株；

（2）牛樟芝孢子悬液的制备：在新的固体培养牛樟芝菌落中加入无菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子悬液；

（3）牛樟芝菌液体种子培养：将制备好的孢子悬液加入液体种子培养基中培养，通过优化培养条件和培养基组成，使液体种子形成规则的小球状；

（4）第一阶段液体发酵：将步骤（3）的液体种子接种至液体发酵培养基中，100-180rpm，20-26℃，培养8-12d；液体发酵培养基组成为: 葡萄糖15-25 g/L，蛋白胨5-10 g/L，K₂HPO₄0.5-1.5 g/L，MgS0₄·7H₂O 0. 1-0.8 g/L，麦芽浸粉 15-25 g/L，苯酚0.05-0.2 g/L；

（5）第二阶段液体发酵：第一阶段发酵培养后，补加葡萄糖， 调整发酵条件为180-220rpm，27-35℃，培养5-10d；补加葡萄糖的质量按照每1L初始液体发酵培养基补加葡萄糖10-50g；

（6）菌体干重的测定：发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重；

（7）菌体胞内物质提取：取烘干后的菌体，采用常规方法进行破胞处理并提取目标活性物质4- Acetylantroquinonol B。

2.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤（1）中固体培养基组成为：葡萄糖10-30 g/L，蛋白胨2-5 g/L，麦芽浸粉 10-30g/L，琼脂 20-35 g/L。

3.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤（2）孢子悬液中含有孢子数为10⁶-10⁷个/mL。

4.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤（3）中液体种子培养基组成为：葡萄糖10-30 g/L，蛋白胨5-15 g/L，KH₂PO₄ 0.5-2g/L，MgS0₄·7H₂O 0.05-0.2 g/L，116℃灭菌25min。

5.如权利要求1所述一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，所述步骤（4）中液体种子的接种量为10%-30%。

6.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，利用高效液相色谱对所述步骤（7）提取得到的目标活性物质4- Acetylantroquinonol B进行测定。

7.如权利要求1所述的一种发酵生产4- Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）菌种的扩大培养：利用挖块接种法，将牛樟芝菌Antrodia camphorata BCRC 35396菌株接种至新的固体培养基中，固体培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨2.5 g/L，麦芽浸粉 20 g/L，琼脂 25 g/L，避光培养20-25天后，新的圆形菌落形成，直径4-5cm，菌落中心呈橙色，边缘呈白色，保存于4℃备用；

（2）牛樟芝孢子悬液的制备：将4℃保存菌种于室温中放置1-2h后，无菌条件下加入10-15mL无菌水，用玻璃棒刮下菌落表面的孢子，最终菌悬液呈浑浊的橙色，其中孢子数为10⁶-10⁷个/mL；

（3）牛樟芝液体种子的培养：装液量为100mL/250mL三角瓶，培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgS0₄·7H₂O 0. 1 g/L，116℃灭菌25min；加入1-2 mL制备好的孢子悬液 ，置于110rpm，25℃的恒温摇床中培养3-4天，菌体呈规则的小球状，直径为1-2mm，可接种至发酵培养基中；

（4）第一阶段液体发酵：将步骤（3）的液体种子以20%的接种量接种至液体发酵培养基中，装液量为50mL/250mL，发酵培养基组成为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨8 g/L，K₂HPO₄ 0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0. 8 g/L，麦芽浸粉 20 g/L，苯酚0.12 g/L，置于140rpm，24℃的恒温摇床中培养12天；

（5）第二阶段液体发酵：第一阶段发酵培养后，补加1g葡萄糖，置于180rpm，28℃的恒温摇床中培养8天；

（6）菌体干重的测定：发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重；

（7）菌体胞内物质提取：取烘干后的菌体，超声法破胞，提取胞内物质，利用高效液相色谱配合紫外检测器进行测定。