[发明专利]一种干酪乳杆菌电转化方法

权利要求书

1.一种干酪乳杆菌电转化方法，其特征在于，所述的方法包括了干酪乳杆菌培养、干酪乳杆菌电转化 和转化后再培养，具体步骤为：

干酪乳杆菌培养：

A.从低温冷冻冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳杆菌菌种，在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧倒 置培养；

B.用无菌的接菌环挑取在MRS上生长好的菌落至试管里MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜；

C.第二日将前一天生长好的菌液1mL转接到50mLMRS液体里，37℃静止生长至菌液600nm处紫外吸 收值为0.5-0.6时，准备干酪乳杆菌电转化；

干酪乳杆菌电转化:

D.将干酪乳杆菌移入50mL离心管里，放到冰盒里静置20分钟后，放到提前预冷到4℃离心机中 5000r/min，5分钟，弃掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mLEPWB溶液，使沉淀悬浮于EPWB溶液中， 放到提前预冷到4℃的离心机中5000r/min，5分钟，弃掉水相，留下菌体，此步骤重复3次，用40mLEPB 溶液洗涤菌体一次，弃上清；

E.菌体用400μL的EPB溶液重悬，分装500-300μL/支(现用现配)，用于电转；

F.质粒DNA1μg加入到之前制备好的干酪乳杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴10分钟；

G.将质粒与干酪乳杆菌感受态转入提前预冷的2mm电击杯中，冰浴10分钟；

H.用滤纸将电转化杯表面擦干，放入电转仪中，调节电压2.3kV、电阻200Ω、电容25μF，脉冲时间 约为4-5ms；

I.向电击杯中快速加入900μL的含有0.5％甘氨酸的MRS，轻轻地用移液器吹吸混合后移到一个无菌 的Eppendorf管中，放到提前调至37℃的80-100rpm/min摇床内孵育1.5-3小时；

转化后再培养:

J.孵育后的混合液离心，留下100μL上清，重新悬浮；然后涂布于含有选择压力的MRS琼脂平板上， 37℃无氧倒置培养24-36小时。

2.如权利要求1所述的一种干酪乳杆菌电转化方法，其特征在于：所述的MRS培养基为莫匹罗星锂盐 改良MRS培养基，所述的EPWB溶液为：NaH₂PO₄0.6mmol/L和MgCl₂0.1mmol/L配置而成，所述的EPB溶 液为EPWB溶液基础上加入0.3mol/L蔗糖，调节pH为7.4，并灭菌4℃保存。