[发明专利]多功能荧光蛋白纳米线及其介导的免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，特别涉及一种多功能荧光蛋白纳米线及其介导的 免疫分析方法。

背景技术

蛋白微阵列分析(ProteinMicroarray)技术又称蛋白芯片技术，可用于大规 模蛋白质相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、各种蛋白质谱学分析、蛋白-核 酸相互作用分析、蛋白质-小分子(药物筛选)相互作用分析等。其基本原理类 似于酶联免疫吸附分析(ELISA)，将大量不同的目标蛋白按照指定顺序固定于 固相载体(玻片、云母)表面，通过荧光标记抗体或相互作用分子指示靶标蛋白 的位置，从而获取相互作用的信息。蛋白芯片技术使得复杂相互作用网络的构建 和多目标分子同时检测成为现实。

传统的蛋白芯片是通过在抗体或相互作用分子的表面修饰荧光分子来进行 信号输出，其修饰的荧光分子数量有限，过多的荧光分子修饰也会影响抗体或相 互作用分子的结合能力，这限制了蛋白芯片灵敏度的提高。随着技术的发展，常 规蛋白芯片的分析灵敏度1-100ng/mL(EspinaV等，Proteinmicroarraydetection strategies:focusondirectdetectiontechnologies，J.Immunol.Methods.290， 121–133，2004.)已经无法满足临床检测和科学研究需求，亟需高灵敏的蛋白芯 片检测技术。

现有蛋白芯片的荧光检测信号放大方法主要包括：

(1)银染增强(CN101539573、CN1743845A)，通过在特异性结合分子标 记的纳米金的表面进行银离子的还原，从而使标记的纳米金信号增强，是一种基 于化学反应的信号扩增方法；然而，银染增强的方法过程复杂，容易产生较强的 背景信号，灵敏度提升有限。

(2)量子点(MeiHu等，Ultrasensitive,MultiplexedDetectionofCancer BiomarkersDirectlyinSerumbyUsingaQuantumDot-BasedMicrofluidicProtein Chip，ACSNano.2010.Jan；4(1):488-494.)，该方法利用量子点本身较好的荧光 性质，将其标记在抗体等特异性结合分子上，从而提高蛋白芯片的荧光信号响应； 然而，量子点修饰过程复杂，容易发生荧光淬灭，批量生产的质控困难，且成本 高昂，至今未进入大规模的商业化生产。

(3)碳纳米管介导的拉曼增强(BeausoleilSA等，Aprobability-based approachforhigh-throughputproteinphosphorylationanalysisandsitelocalization， NatBiotechnol.2008.Nov；26(11):1285-92.)，通过在碳纳米管的表面反复还原 金和银，形成粗糙的金属表面，从而得到表面增强拉曼信号，用于蛋白芯片检测 的信号放大；然而，碳纳米管拉曼标记的制备、标记过程复杂，需要专用的仪器， 方法不通用。

(4)病毒载体介导的荧光信号放大(KimE.Sapsford等，Acowpeamosaic virusnanoscaffoldformultiplexedantibodyconjugation:Applicationasan immunoassaytracer，BiosensBioelectron.2006,21(8):1668-1673.)，利用病毒颗 粒较大的比表面积和丰富的表面反应基团，同时修饰抗体和荧光染料，通过病毒 颗粒本身来结合大量的荧光分子，从而在结合目标分子时提高荧光分子的数量来 达到信号放大的目的；然而，病毒载体介导的荧光信号放大方法灵敏度提升有限， 且制备过程复杂，不可控。

上述现有技术中，无论是通过提高标记分子的荧光强度(或通过化学反应来 提高标记信号强度)还是提高标记荧光分子数量来放大蛋白芯片的信号，均存在 灵敏度提升不足、制备复杂、成本高等缺陷。

发明内容

本发明为克服现有技术中免疫检测尤其是蛋白芯片检测灵敏度不足、制备复 杂等缺点，提供一种多功能荧光蛋白纳米线及其介导的免疫分析信号放大方法， 以荧光分子作为信号分子，在位于多功能荧光蛋白纳米线两端的荧光分子表面修 饰功能配体作为结合分子，可用于提高免疫检测灵敏度。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：