[发明专利]一种基于蛋白纳米线的3D探针‑磁性微珠复合物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物及其在免疫检测中的应用。

背景技术

各种传染性疾病大范围的流行传播，对我国的国家安全和人口健康造成严重威胁。发展灵敏、准确的病原分析方法和检测技术对于相关疾病的快速诊断和及时治疗、生物恐怖和突发性公共卫生事件的有效防范和快速处置具有重要意义。经典的微生物分离鉴定麻烦费时，难以应用于致病微生物的现场快速检测；基于病原核酸的检测方法大多具有较高的检测灵敏度，但需要复杂的核酸抽提过程，而且容易出现假阳性；免疫学方法因基于抗体对病原的特异性识别作用而具有较好的特异性，同时操作简单，因此，广泛应用于临床和基础研究的各个领域。

常规的免疫分析方法，如ELISA，其过程主要依赖于抗体的特异性捕获和固相亲和分离等过程，因此有着特异性好，背景信号低，灵敏度高等特点。但随着社会的不断发展，在海关、口岸和CDC等进出口人员、货物密集交通的地方，对现场、快速、高灵敏的病原检测有着非常高的要求，也是国家疾病防控的重要关口。目前，常规的ELISA检测中，固定蛋白探针是通过物理吸附作用，使得蛋白探针随机取向，且吸附作用是在二维平面上的，其固定密度较低，导致捕获检测物的效率降低而限制其灵敏度；在操作过程中，包被、封阻、结合、洗涤需要花费大量时间，限制了对样品的现场检测。而快速免疫分析方法，如试纸条等，虽然能够实现快速检测，但由于该方法通常通过肉眼识别纳米金聚集显色，其灵敏度更是低于ELISA。针对于此，我们亟需开发一种快速、高灵敏的免疫检测方法。

现有提高蛋白探针固定有效方向和密度而调高灵敏度的方法有：亲和作用(Analytical Chemistry，1999，71(17):3846-3852.)、硅纳米线介导(Nature biotechnology，2005，23(10):1294-1301.)、病毒纳米颗粒介导(Nature nanotechnology，2009，4(4):259-264.)、巨磁阻介导(Nature nanotechnology，2011，6(5):314-320.)等。

亲和作用介导的固定法是通过亲和素-生物素系统，使得探针的固定随机性降低，从而提高有效探针密度；硅纳米线介导的固定法是在硅纳米线表面修饰上醛基，将抗体探针通过氨基与醛基形成化学键而在其表面展示，达到高密度的固定；病毒纳米颗粒介导的固定法是将SPA融合在病毒衣壳蛋白亚基上，通过SPA与抗体的作用而展示抗体，另外通过病毒衣壳蛋白上的His-tag与镍纳米阵列作用，达到高密度的固定；巨磁阻介导的固定法是利用亲和素-生物素系统将抗体结合在磁颗粒上，磁颗粒通过巨磁阻效应固定在界面上，从而达到抗体探针的高密度展示。

上述方法中，提高蛋白探针的固定密度主要通过两种途径来实现：一、通过特异性的固定代替随机的物理吸附；二、提高固定蛋白探针的数量。前者提高探针数量有限，如亲和作用介导的固定只能在一定程度上解决探针随机取向的问题，并不能提高真实探针密度；而病毒纳米颗粒介导的固定法受限于病毒颗粒的大小，固定的探针数量有限，且His-tag与镍的作用不稳定。后者需要通过复杂的化学修饰过程，或者需要复杂的仪器和操作步骤，成本高昂，如纳米材料虽然能够提高比表面积，但其修饰方法随机、复杂，且在修饰过程中会损伤蛋白探针的生物活性，导致捕获能力降低。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的在三维(3D)空间上的免疫检测。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明一方面提供一种基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物，包括磁性微珠和蛋白纳米线，所述蛋白纳米线通过成线蛋白自组装形成，且所述蛋白纳米线表面包括至少一种功能配体和至少一种连接配体，所述蛋白纳米线通过连接配体连接在磁性微珠表面。