[发明专利]一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法

权利要求书

1.一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应；

所述裂解液的组成为：0.2～0.4N氢氧化钠、0.3～0.6M氯化钾、0.01～0.05％N-月桂酰肌氨酸钠、5mM EDTA、0.3～0.6M Tris-HCL、3～8mM DTT和1～2％曲通X-100；

所述洗涤使用的洗涤液为0.3～0.6M氯化钾溶液，所述洗涤液的pH值为4～5。

2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述裂解液还包括不多于0.001wt％的提取指示剂，所述提取指示剂选自溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹名、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。

3.根据权利要求2所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述提取指示剂为溴酚蓝。

4.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1)将混合有磁珠的裂解液加入到PCR扩增管中；

步骤2)将待检测样品加入到所述混合有磁珠的裂解液中，混匀，室温静置5～10分钟；

步骤3)将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后将混合液吸出；

步骤4)将PCR扩增管从磁力架上取下，将洗涤液加入步骤3)得到的PCR扩增管中，再将其放回磁力架上，待磁珠吸附至一侧后，立即将洗涤液吸走；

步骤5)将配制好的PCR反应液加入到步骤4)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行实时荧光定量PCR反应。

5.根据权利要求1、2或4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述混合有磁珠的裂解液中磁珠和裂解液的体积混合比例为1～1.5：100。

6.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述混合有磁珠的裂解液、待检测样品和洗涤液的体积比为1：1：2。

7.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤2)所述待检测样品的加入量为50μl～150μl。

8.根据权利要求7所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述待检测样品的加入量为100μl。

9.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤2)所述待检测样品为细胞、细菌、血清、血浆、唾液、尿液或胸腹水。

10.根据权利要求9所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述待检测样品为血清或血浆。

11.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述洗涤液还包括不多于0.001wt％的洗涤指示剂，所述洗涤指示剂选自溴酚蓝、石绿、甲基红、甲基橙、罗丹名、溴甲酚绿、品红、二甲酚橙、二苯胺或刚果红中的一种。

12.根据权利要求11所述的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述洗涤指示剂为石绿。