[发明专利]增强的蛋白质表达

说明书

本发明总体上涉及具有导致感兴趣的蛋白质的表达增加的遗传改变的细菌细胞，以及制造和使用此类细胞的方法。本发明的方面包含具有遗传改变的革兰氏阳性微生物，如芽孢杆菌属的成员，该遗传改变延迟、降低、或阻断用于孢子形成的基因的表达或激活，从而导致感兴趣的蛋白质表达的增强。该遗传改变是降低kinA基因、phrA基因或phrE基因的表达的遗传改变。

相关申请的交叉引用

本申请要求在35U.S.C.§119下于2014年12月19日提交的美国临时专利申请号62/094,751的优先权，其整体通过引用并入本文。

发明领域

本发明总体上涉及具有导致感兴趣的蛋白质的表达增加的遗传改变的细菌细胞，以及制造和使用此类细胞的方法。本发明的方面包括具有遗传改变的革兰氏阳性微生物，如芽孢杆菌属的成员，该遗传改变延迟、降低、或阻断用于孢子形成的基因的表达或激活，从而导致感兴趣的蛋白质的表达增强。遗传改变的实例包括降低KinA、PhrA、和/或PhrE的表达或活性的那些。

序列表的引用

命名为NB40522-WO-PCT_SequenceListing.txt的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2015年11月30日，并且大小为18KB，通过引用并入本文。

本发明的背景

遗传工程已经允许改进在食品发酵中用作工业生物反应器和细胞工厂的微生物。包括多个芽孢杆菌物种的革兰氏阳性生物体被用于产生大量有用的蛋白质和代谢产物(参见，例如，Zukowski,“Production of commercially valuable products,”In:Doi andMcGlouglin(eds.)Biology ofBacilli:Applications to Industry,Butterworth-Heinemann,Stoneham.Mass pages 311-337,1992[Zukowski，“有商业价值的产品的生产”，在：Doi和McGlouglin(编辑)杆菌生物学：工业应用，巴特沃思-海涅曼出版公司(Butterworth-Heinemann)，斯通哈姆，马萨诸塞州，第311-337页，1992中])。工业中使用的常见芽孢杆菌属物种包括地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。由于其GRAS(通常被认为是安全的)状态，这些芽孢杆菌属物种的菌株是用于生产用于食品和制药工业的蛋白质的天然候选物。在革兰氏阳性生物体中产生的蛋白质的实例包括酶，例如α-淀粉酶、中性蛋白酶、和碱性(或丝氨酸)蛋白酶。

尽管对细菌宿主细胞中蛋白质的生产的理解有所进展，但是仍然需要开发新的表达增加水平的感兴趣的蛋白质的重组菌株。

发明概述

本发明提供表达增加水平的感兴趣的蛋白质的重组革兰氏阳性细胞及其制备和使用方法。特别地，本发明涉及具有遗传改变的细菌细胞，与不具有遗传改变的细菌细胞相比，所述遗传改变导致感兴趣的蛋白质的表达增加。因此，本发明的方面包括革兰氏阳性微生物，如芽孢杆菌属的成员，这些革兰氏阳性微生物包含降低用于激活磷酸化途径的基因的表达的遗传改变(例如，参见图5中磷酸化途径原理图)并且从而导致感兴趣的蛋白质(下文称为“POI”)的表达增强。还提供了制备和使用这些重组细菌细胞的方法。

本发明的方面包括用于从革兰氏阳性细菌细胞增加POI的表达的方法，这些方法包括：(a)获得产生POI的经改变的革兰氏阳性细菌细胞，其中该经改变的革兰氏阳性细菌细胞包含降低激活磷酸化途径的一种或多种蛋白质的表达或活性的至少一个遗传改变，并且(b)在表达POI的条件下培养所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞，其中在基本上相同的培养条件下，该POI的增加的表达是相对于未经改变的(亲本)革兰氏阳性细菌细胞中相同POI的表达而言的。在某些实施例中，降低激活磷酸化途径的一种或多种蛋白质的表达或活性的遗传改变是kinA基因、phrA基因和/或phrE基因的遗传改变。