[发明专利]噬菌体λ整合酶的突变体

说明书

本发明涉及包含在如SEQ ID NO：1所示的λ整合酶的第43、319和336位的至少一个氨基酸突变的λ整合酶。本发明进一步涉及包含编码突变型λ整合酶的核苷酸序列的核酸分子和含有这些核酸分子的宿主细胞。本发明还涉及在所述突变型λ整合酶和序列特异性重组试剂盒存在下将目标核酸重组到靶核酸中的方法。

技术领域

本发明涉及噬菌体λ整合酶的突变体和包含编码此类突变体的核苷酸序列的核酸分子。

背景技术

噬菌体整合酶是介导两个DNA识别序列(噬菌体附着位点attP和细菌附着位点attB)之间的单向位点特异性重组的酶。基于它们的催化模式，可将整合酶分为两个主要家族，即酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶。

酪氨酸家族整合酶如λ整合酶利用催化酪氨酸来介导链切割，倾向于识别更长的attP序列，并且需要由噬菌体或宿主细菌编码的其它蛋白质。

来自丝氨酸家族的噬菌体整合酶更大，使用催化丝氨酸用于链切割，识别更短的attP序列，并且不需要宿主辅因子。噬菌体整合酶介导相对较短，但长度在基因组规模上足以是特异性的两个不同序列之间的有效位点特异性重组。

这些性质使得噬菌体整合酶对于活的真核细胞(尤其是具有大基因组的那些，如哺乳动物和大多数植物)的遗传操作变得越来越重要，对于这些真核细胞进行精确操纵基因组的工具很少。

对于λ整合酶在催化位点特异性DNA重组方面的用途已经过广泛研究。例如，两种突变型λ整合酶(Int-h(E174K)和其衍生物Int-h/218)(E174K/E218K))已经被描述，并且显示在人细胞中至少与相应的分子内重组反应一样有效地催化分子间重组反应。虽然已显示臂位点序列的存在在体内通过Int-h/218增加核心位点的重组，但考虑到在人类基因组中不存在attB位点，重组反应在非同源位点中以基本上随机的方式发生。

这使得难以以受控的可再现的方式改造细胞系。

因此，仍然需要提供在催化位点特异性重组反应方面具有更大效率和特异性的突变体整合酶。

发明内容

在一个方面，提供了包含选自由I43F、E319G和D336 V组成的组的至少一个氨基酸突变的λ整合酶。

在另一方面，提供了包含在如SEQ ID NO:1所示的λ整合酶的第336、319和43位中的至少一个位置处的氨基酸突变的λ整合酶。

在另一方面，提供了一种核酸分子。所述核酸分子包含编码如本文所述的突变体的核苷酸序列。

在又一方面，提供了一种宿主细胞。所述宿主细胞包含如本文所述的核酸分子。

在再一方面，提供了将目标核酸重组到靶核酸中的方法。所述方法包括在如本文所述的突变体存在下使包含目标核酸的靶向核酸与靶核酸接触。

在又一方面，提供了序列特异性重组试剂盒。所述试剂盒包含可插入有目标核酸的靶向核酸和如本文所述的突变体。

定义

本文所用的以下词语和术语应当具有所指示的含义：

术语“突变体”是指因突变或重组DNA程序而产生的蛋白质。

术语“Int”或“整合酶”是指λ噬菌体整合酶蛋白质。

如本文所用的“核酸”是指呈任何可能的构型如线性化单链的、双链的或其组合的任何核酸。核酸可包括但不限于DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物或使用核酸化学生成的DNA或RNA的类似物、cDNA合成的DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸和PNA(蛋白质核酸)。DNA或RNA可是基因组来源或合成来源的并且可以是单链的或双链的。相应的核酸可另外含有非天然核苷酸类似物和/或连接到亲和标签或标记。