[发明专利]用于定量评价DNA-蛋白质复合物密度的组合物和方法

说明书

本发明的一个方面描述了定量测量染色质中给定DNA基因座上结合DNA的蛋白的密度和占据百分比的材料和方法，所述结合DNA的蛋白例如组蛋白、组蛋白变体、组蛋白翻译后修饰物和转录因子。一个实施方案测量了特定基因座上某因子(factor)的平均数量并控制涉及抗体质量的许多缺陷和处理事宜。其它实施方案包括校准和量化染色质免疫沉淀试验、评估亲和剂特异性以及试剂盒中所需的试剂及其配制。另一个实施方案允许通过测量基因组基因座上组蛋白修饰密度来进行病症或疾病的诊断。

相关申请

本申请要求享有2014年2月3日提交的美国临时专利申请第61/935,129号的提交日的权益，该申请的内容在此以引用的方式并入本文。

联邦政府资助的研究

本发明在美国政府的支持下完成，基金号为NIH-1R21HG007426。美国政府拥有本申请的某些权利。

背景

染色质即蛋白质与DNA的集合物，其是基因组的生理形式，是DNA基本功能的重要调节物，在DNA代谢、细胞和整个有机体功能中发挥关键作用。染色质结构的基本重复单位是核小体：8个核心组蛋白(两个拷贝的H2A、H2B、H3和H4)的DNA结合轴状物(spool)，基因组DNA缠绕8个核心组蛋白近两整圈。例如，可通过微球菌核酸酶消化来产生单个核小体。组蛋白包括H1组蛋白、H2A组蛋白、H2B组蛋白、H3组蛋白和H4组蛋白，并且可被修饰为包含多个表位和翻译后修饰。

在细胞中，组蛋白的翻译后修饰(或氨基酸序列的变化)能够调节局部染色质状态的变化，所述局部染色质状态的变化控制基本DNA的可及性，从而调节从转录激活到基因沉默的过程。这些化学修饰称作“表观遗传标记”，增加了另一信息层而不改变DNA的标准碱基配对容量，而且似乎互相作用并与其它区别染色质特征配合以控制基因组。多种细胞过程例如转录、复制、干细胞多能性、基因沉默、X染色体失活、DNA修复、细胞凋亡、表观遗传、细胞身份记忆(cellular identity retention)、造血、癌症、多种中枢神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病、肥胖、细菌感染以及发育期间的基因表达程序都似乎在其过程或因果关系中涉及表观遗传修饰。

染色质免疫沉淀(ChIP)是发现这些表观遗传修饰存在于基因组何处以及追踪它们随着发育和病理转变(例如造血干细胞到白细胞)中细胞身份信息的变化而变化的主要方法。ChIP是本领域熟知的。简言之，ChIP是拉下试验(pull-down assay)，其依赖于通过机械、物理、化学或酶法剪切使活生物体的基因组物质片段化以产生蛋白质-DNA片段池(主要为核小体)，然后用亲和剂例如结合特定蛋白或其翻译后修饰的抗体探测(probed)所述蛋白质-DNA片段池以拉下特定染色质片段。ChIP利用从片段化的染色质“输入”库进行的亲和捕获来富集携带有感兴趣的表位的片段。可通过本领域已知的包括RT-PCR、下一代测序、ddPCR，qPCR、微阵列探针杂交的多种技术和能够读出且量化DNA序列的其他方法来鉴定间接捕获的DNA片段的身份信息、相对丰度和在基因组中的位置。

然后，这种与蛋白质原位结合的DNA位置有关的信息可用于推断完整基因组中与DNA结合的蛋白质的位置，并评估与该序列在经受亲和捕获的初始片段池(pool)即“输入”中的频率相比或相对于一些其他的基因组基因座，该DNA基因座上存在多少结合的物质。换言之，将所捕获的物质用qPCR、下一代测序等进行分析并与阴性对照进行比较以评估也称作拉下试验(pull-down)的免疫沉淀所给予的相对富集。明显的是，现有技术从相对意义上回答了“在基因组何处”这一问题，但并没有提供与该位点上靶向表位的实际丰度有关的重要信息。然而，ChIP提供了对位置、组蛋白标记和组蛋白变体的组合如何能够调控基因表达(Henikoff，2008；Jiang和Pugh,2009；Li和Carey,2007)以及这些变化如何能够调控细胞分化(Bernstein等,2007)的深刻见解。而且，它是理解表观遗传学在癌症和其他疾病中的作用包括发现疾病标记物的关键工具(Dawson和Kouzarides,2012；Feinberg,2007)。