[发明专利]一株高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点

说明书

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一株高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点。本发明提供了一株生产嘧啶核苷的枯草芽孢杆菌突变株和一个氨甲酰磷酸合成酶的编码基因，明确了一个与氨甲酰磷酸合成酶受终产物反馈抑制相关的关键调控位点，可以为以后嘧啶核苷高产菌株的选育提供参考。所提供的枯草芽孢杆菌突变株，通过发酵法生产核苷嘧啶尿苷产量可达13.5±1g/L，并且对不同嘧啶核苷结构类似物的耐受性显著提高。

技术领域：

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一株高产嘧啶核苷的菌株及其氨甲酰磷酸合成酶调节位点。

背景技术：

嘧啶核苷包括尿苷和胞苷，是一切生物体的重要组成成分，它们用途广泛，尤其是作为抗病毒抗肿瘤药物的中间体，在医药领域占有重要地位。嘧啶核苷的生产方法有化学合成法，水解RNA法和微生物发酵法，综合几种方法的优缺点，微生物发酵法因其周期短、易控制、产率高、污染小等优点，具有大规模工业化的潜力，因此日益受到人们的重视。

嘧啶核苷生产菌株的选育始于20世纪60年代，国内外有关嘧啶核苷高产菌株的选育基本上都是诱变结合结构类似物抗性菌株筛选的方法，其中以日本武田化学公司的研究最为突出。

武田公司在高产尿苷菌种选育的过程中先以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，经过NTG诱变，选育出一株尿嘧啶缺陷型菌株No.122，该菌株在提供50mg/L尿嘧啶情况下，能够积累乳清酸8.58g/L(50mM)乳清酸和7.78g/L(27mM)乳清酸核苷；在No.122的基础上，再次经过NTG诱变，在含有300mg/L 6-氮杂尿嘧啶的培养基中筛选到菌株No.258，此菌株积累尿苷10g/L，尿嘧啶7g/L。继续NTG诱变，在含有5g/L的6-氮杂尿嘧啶培养基中筛选到菌株No.508，该菌株积累尿苷46g/L，尿嘧啶6g/L。最后，为了降低副产物尿嘧啶的积累量，继续进行诱变，筛选到一株尿苷磷酸化酶几乎活性丧失的菌株No.556，能够积累尿苷55g/L，尿嘧啶积累量＜1g/L，通过对培养条件及培养基成分的优化，在6000L发酵罐中稳定积累尿苷65g/L。

他们对高产胞苷菌种的选育同样基于No.122菌株。首先通过NTG诱变后，筛选出一株一株胞苷脱氨酶缺失菌株No.229，积累胞苷0.2g/L，尿苷1g/L，此菌株在50mg/L 5-氟胞苷的存在下即失去生长能力。因此，继续诱变后，获得一株能耐受500mg/L 5-氟胞苷的菌株No.344，该菌株积累胞苷10.4g/L。经酶活性验证实验得知，此菌株与No.122菌株相比，氨甲酰磷酸合成酶和CTP合成酶的活性均提高了十倍以上。经过对该菌株的进一步诱变处理，筛选出能够耐受12g/L 3-脱 杂氮尿嘧啶菌株No.428，能够积累胞苷14.2g/L，该菌基本上解除了CTP合成酶所受的反馈调节作用。之后，通过同源重组在No.428中引入了突变，获得了不受反馈抑制的氨甲酰磷酸合成酶菌株No.515，使胞苷产量达到18.8g/L。再经过NTG诱变，获得了一株高丝氨酸脱氢酶缺失菌株No.615，该菌株能积累胞苷23.5g/L，最后通过对碳源葡萄糖浓度的调整优化，该菌株在60吨发酵罐中能够积累胞苷30.2g/L，并且产量稳定。

而日本武田公司虽然在嘧啶核苷高产菌株的选育方法取得了丰硕成果，其选育的菌种产苷能力也在国际上遥遥领先，但是受当时技术条件限制，他们并没有指出与嘧啶核苷高产息息相关的氨甲酰磷酸合成酶关键调控位点。

B.subtilis有两种氨甲酰磷酸合成酶(EC 6.3.5.5，carbamoyl phosphatesynthetase，CPSase)：一是pyrAA/pyrAB基因编码，催化UMP从头合成途径的第一步反应；二是carA/carB基因编码，参与精氨酸生物合成。虽然，这两种氨甲酰磷酸合成酶都催化谷氨酰胺与CO₂反应，消耗2分子ATP生成氨甲酰磷酸。但是，B.subtilis的两个氨甲酰磷酸合成酶生理功能不同，它们的表达和酶活性调节机制也完全不同。