[发明专利]一种重组慢病毒在HIV表型耐药检测中的应用

权利要求书

1.一种重组慢病毒的制备方法，该重组慢病毒是包装质粒、包膜质粒和转移质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体；其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒；所述转移质粒为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen质粒；所述转移质粒的构建方法，包括以下步骤：使用BamH I和Kpn I双酶切pMD2.G质粒，回收酶切产物，收取119bp CMV片段；将pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen质粒用BamH I和Kpn I进行双酶切，回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段；将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4 DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒；使用NcoI和XbaI双酶切PGL3-Promoter Vector，回收1906 bp Luciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用NcoI和XbaI双酶切，回收4855bp的片段，将该片段和Luciferase片段用T4 DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen；所述psPAX2m-pol质粒序列如SEQ ID No.6所示；所述psPAX2m-pol质粒的构建方法，包括以下步骤：

（1）psPAX2载体重建：利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点AgeI，获得psPAX2-1载体；利用定点突变试剂盒突变psPAX2-1载体的酶切位点ApaI，获得psPAX2-2载体；DpnI 酶切psPAX2-2载体，酶切产物转化XL 10-GOLD感受态细胞，质粒提取，ApaI酶切该质粒，挑取酶切产物鉴定测序，获得psPAX2m载体，其序列如SEQ ID No.4所示；

（2）psPAX2m-pol质粒构建：利用PCR扩增pol片段，其序列如SEQ ID No.5所示；用ApaI和AgeI酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体，得到psPAX2m-pol质粒，其序列如SEQ ID No.6所示。

2.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，所述转移质粒结构如图1所示。

3.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所示。

4.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，所述psPAX2-1载体的序列如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，所述psPAX2-2载体的序列如SEQ ID No.3所示。

6.根据权利要求1所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，所述psPAX2m载体的序列如SEQ ID No.4所示。