[发明专利]一种纯化氧化含二硫键多肽的方法

说明书

本发明涉及一种纯化氧化含二硫键多肽的方法，将待纯化氧化的粗肽在色谱柱上进行分离，同时进行氧化；其是将粗肽以流动相A相和B相进行冲洗，在纯化的同时进行二硫键的氧化，纯化后得到的就是氧化后的多肽；其中，A相中包含氧化二硫键的氧化剂。发明提供的液相二硫键氧化方法，区别于传统氧化思路，可以弥补固相氧化收率低、传统液相氧化方法费时费力的缺点，大大提高收率，并且易于放大生产。

技术领域

本发明涉及一种多肽药物的纯化方法。

背景技术

一对或多对半胱氨酸残基之间所形成的二硫键对维持多肽空间构象以及某些生物学活性起着重要的作用。现有的许多药物都需要二硫键的存在才具有活性，例如如：奥曲肽、奈西立肽、爱啡肽、阿托西班和特利加压素等等，因此二硫键的氧化方法一直是多肽行业研究的重点。

目前多肽二硫键氧化的常规方法是先采用空气、双氧水、碘等氧化剂进行氧化，再利用反相液相色谱进行纯化，得到最终产物。此方法虽然在15min-30min即可完成氧化，氧化速度较快，但停止氧化反应后还需要经过反相液相色谱纯化，才能得到所需的产物。而不同的氧化方法，在进行下一步反相色谱纯化前的处理过程也不相同。例如爱啡肽按照常规方法用双氧水氧化后，溶液体积较大，需多重过滤后方可进行纯化；奈西利肽先用氧气氧化，再经过旋蒸、过滤后，方可进行纯化，等等。这些方法的步骤都过于繁琐，需控制的参数也多，不利于对多肽质量的控制。多肽的稳定性本身较差，特别对于一些性质极不稳定的多肽而言，在终止氧化反应后，进行后续步骤之前，强氧化剂就有可能已经破坏了多肽本身的结构，引起多肽变性。所以减少氧化操作步骤，缩短处理时间对提高氧化收率，控制产品质量显得尤为重要。本发明为解决这些问题，提供了一种在纯化的同时完成多肽氧化的方法。不仅简化了操作过程，缩短了整个工艺的处理时间，更加避免了多肽与强氧化剂长时间接触引起的结构不稳定，所导致的收率降低。

对于多肽的二硫键氧化主要有以下几种方式，一是多肽固相或液相合成过程中进行氧化，经过裂解后，得到的就是氧化产物，然后进行纯化，如：CN 102827249A；二是固相合成线性粗肽，裂解后将线性粗肽溶解后进行液相氧化，然后再进行纯化如：CN 103304655A、CN 104710509 A；或是将线性粗肽纯化提高纯度后再进行二硫键氧化，以提高氧化产物纯度或反应效率，但是每种二硫键氧化方法都有其优缺点，固相氧化对某些短肽或某些只需成一对二硫键的多肽更为合适；液相氧化费时费力，但氧化后的纯度相对较高，对于后续纯化提供了便利。为了提高药物的安全性，现有多肽药物要求纯度越高越好，大多要求纯度大于99％，并需对单杂进行控制，要求单杂小于0.15％，固相氧化杂质较多，不利于质量控制；如果采用液相氧化后进行纯化，虽然液相氧化完全，纯度较高，但氧化处理工序较繁琐，费时费力。

本发明提供了一种新液相二硫键氧化方法，区别于传统氧化思路，可以弥补固相氧化收率、纯度低，传统液相氧化方法费时费力的缺点，操作简便的同时大大提高氧化纯度及收率，并且易于放大生产。

发明内容

本发明涉及一种新的液相氧化方法，将多肽药物线性粗肽直接在制备色谱柱上实现二硫键氧化。主要是以含有氧化剂的溶液为A1相，以有机溶剂为B相，在色谱柱上梯度洗脱多肽药物的同时，对多肽药物线性肽进行氧化，收集到的样品即为氧化后的多肽原料药。

本发明涉及一种纯化氧化含二硫键多肽的方法，将待纯化氧化的粗肽在色谱柱上进行分离，同时进行氧化；其是将粗肽以包含氧化剂的流动相进行洗脱同时氧化；

优选地，包括以下步骤：

将粗肽以流动相A相和B相进行冲洗，

其中，A相为无机盐水溶液，A相中还包含氧化二硫键的氧化剂；