[发明专利]一种混合佐剂的EV71亚单位疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于包括EV71的VP1蛋白以及铝 和MPLA联用的混合佐剂。

2.如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于EV71的VP1 蛋白的编码核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，EV71的VP1蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所 示。

3.如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于所述的EV71 的VP1蛋白为大肠杆菌中重组表达并经过超声、洗涤、变性得到。

4.如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于表达的VP1蛋 白不带任何多余的序列，且在变性条件下经过相应的离子交换纯化和分子筛纯化得到。

5.如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于所述的亚单位 疫苗为VP1蛋白在尿素变性条件下和铝佐剂结合，经漂洗液洗涤后与MPLA佐剂混合得到。

6.如权利要求1所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于所用的铝佐剂 为氢氧化铝或者磷酸铝。

7.如权利要求1～6中任一项所述的混合佐剂的人肠道病毒71型亚单位疫苗，其特征在于 VP1蛋白和铝以及MPLA佐剂的重量比为1‐50:1‐100:1‐10；优选25:50:5。

8.如权利要求1所述的肠道病毒71型亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)将SEQIDNO.1所示的VP1序列克隆入pET22b表达载体构建成pET22b‐VP1重组表达载 体，将质粒导入大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达，得到的菌液经过超声离心获得VP1 包涵体蛋白；

(2)包涵体蛋白经过含不同浓度的尿素以及表面活性剂的洗涤缓冲液多次洗涤和离心，最 终用含高浓度尿素的溶液溶解包涵体；溶解的包涵体蛋白在尿素存在的条件下经强阴离子交 换纯化能得到纯度较高的VP1蛋白，进一步用凝胶过滤层析纯化后得到纯度超过95％的抗原 VP1蛋白；

(3)纯化后尿素溶解的变性VP1蛋白与铝佐剂结合，用生理缓冲液多次洗涤漂去变性剂， 得到铝佐剂和抗原蛋白的混合物，将此混合物与MPLA佐剂混合最终制备成EV71亚单位疫 苗。