[发明专利]一种低危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒

说明书

本发明提供一种低危型人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测试剂盒。它公开了检测用的特异性扩增引物和荧光探针、PCR反应缓冲液、对照品。本发明还提供了用于检测低危型HPV试剂盒制备和使用方法。本发明适用于人尖锐湿疣泌尿生殖道分泌物样本中临床常见的低危型HPV病毒的快速检测，结果灵敏、准确、稳定、特异性高，对尖锐湿疣的诊断和早期预防具有较大的临床意义。

技术领域

本发明涉及一种低危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对（bp），分为3个功能区，即早期转录区（E区）、晚期转录区（L区）和非转录区（长控制区，LCR）。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

HPV根据其基因组核苷酸序列不同，目前已经分离出130多种基因型，不同基因型别引起不同的临床表现。对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。低危型HPV一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌，其中最常见的基因型是6和11型，其次是40、42、43、44型。尖锐湿疣是国家卫生部规定要求监测的八大性传播疾病之一，它的发病率仅次于淋病，由于病情易反复发作，传染性极强，已经成为严重危及人们正常生活的常见性病之一。

由于HPV病毒难于培养，目前临床上检测低危型HPV的常用方法依赖于分子生物学核酸检测方法，主要是荧光PCR法（CN101251469A）、膜杂交固相芯片法（蒋明军等，中华皮肤科杂志，2005,38（5）：262-264）和液相悬浮芯片法（CN100582239C），特别是TaqMan探针荧光PCR法，相对于其它两种方法，具有闭管检测污染少、操作简便快速、结果灵敏准确特异的优点，适用于尖锐湿疣样本中低危型HPV的快速检测，适合在基层临床机构推广使用。

发明内容

本发明提供一种单管低危型人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测试剂盒，其特征在于，试剂盒所用四对荧光PCR扩增引物序列为SEQ ID No：1～SEQ ID No：8，五条荧光探针序列为SEQ ID No：9～SEQ ID No：13，其中荧光探针SEQ ID NO：9和SEQ ID No：10序列5’端标记FAM荧光基团，荧光探针SEQ ID NO：11序列5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团，荧光探针SEQID NO：12序列5’端标记ROX荧光基团，荧光探针SEQ ID NO：13序列5’端标记Cy5荧光基团，这五条探针3’端均标记BHQ淬灭基团。本发明提供的低危型HPV核酸检测试剂盒能实现在单个反应管中通过荧光PCR反应，检测临床常见的低危型HPV，结果灵敏、准确、稳定、特异性高，对尖锐湿疣的诊断和早期预防具有较大的临床意义。

技术方案

通过对GenBank中HPV基因型核苷酸序列查询，用Vector NTI、Oligo等软件对各种HPV基因亚型的L1基因序列进行比对设计，按照TaqMan探针荧光PCR设计的原则，优选了四对引物扩增HPV 6、11、40、42、43、44这六种临床常见的低危型HPV保守区域，并同时优选了五条荧光探针检测这六种HPV亚型，试剂盒中的这些引物和荧光探针核苷酸序列（5’ -3’）如下：

上游引物（SEQ ID NO：1）：AgATgTggCggCCTAg；

下游引物（SEQ ID NO：2）：gTCTAgAACTgCTRgCATg；

上述这对引物扩增HPV6、11、44型基因片段。

上游引物（SEQ ID NO：3）：ATgAAAATCAAgTATATTTACCAC；