[发明专利]一种DNA片段的拼接方法

说明书

本发明提供了一种核酸片段的拼接方法，通过提供一种设计有同源臂及特定酶切位点的DNA载体；提供多个带有同源臂且相邻拼接位置的目标DNA片段首尾相互重叠的待拼接的目标DNA片段；利用无缝克隆将多个待拼接的目标DNA片段一并克隆入所述的DNA载体，从而获得含有更长DNA片段的载体。本发明的方法获得的片段又可以以同样的方式与其他片段进行排接，从而可以源源不断地将更多的片段拼接在一起。在基因工程中，尤其在合成生物学中得到大段的DNA片段非常适用。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物工程技术领域，涉及一种在基因工程操作中的DNA片段克隆和拼接方法。具体地，本发明涉及一种将多个DNA片段首尾拼接形成更长的DNA片段的方法及该方法的应用。

背景技术

DNA(Deoxyribonucleic acid)，又称脱氧核糖核酸，是生命体内重要的遗传物质，也是生命科学和生物技术研究的重要对象和工具。随着基因工程技术和应用的发展，在体外对DNA的操作方式越来越多，比如对DNA分子的扩增、切割、修饰与重新组装等，也称为重组DNA技术，是现代分子生物学发展中最重要的成就之一，也是基因工程的核心技术。

在这些体外DNA操作中，有一个重要的环节是将DNA片段连接到载体中，从而可以利用生物(细菌、酵母、细胞等)对DNA进行扩增、筛选、表达等操作。将DNA片段连接到载体的过程也称为狭义的DNA克隆。

可以作为DNA载体的有质粒、粘粒、噬菌体、人工染色体等，其中质粒载体是应用最为广泛的分子克隆载体。

实现DNA片断克隆到载体中的方法也有多种。比如酶切连接的方法，即DNA分子的切割与连接可以通过限制性内切酶和连接酶来完成，即分别用相应的限制性内切酶切割目标DNA分子和载体DNA分子，使其两端分别获得含有部分单链突出的末端(粘性末端)，含有互补序列的末端(由同一个酶或同尾酶切割获得)在DNA连接酶的作用下形成一条完整的DNA链。也有TA克隆的方法，即在DNA片段末端各添加一个3’-dA碱基，在载体末端各添加一个3’-dT碱基，即可实现DNA片段与载体的连接。还有基于同源片段的连接方法，即在片段和线性化的载体两端分别有相同的序列，通过酶的作用将其连接在一起。

实现单个DNA片段与载体的连接的方法相对比较简单和成熟。如上所述的方法中，分别用一个步骤即可完成。在研究中，尤其是合成生物学应用中，经常需要用到将多个片段连接到一起形成一个更长的DNA分子的过程，通常的方法，可以先将多个片段通过PCR的方法连接到一起，再克隆连接到载体中。也可以先将其中的一个片段克隆到载体中，形成新的载体后再加入新的片段。但这些方法都存在明显的缺点，PCR的方法得到的序列存在一定的突变率，往往需要重新筛选正确克隆，而且PCR方法所能操作的DNA片段数量和长度都有限。先后加入的方法，一方面受酶切位点的限制，随着片段的增加，可选的酶切位点越来越少，另外一方面，遇到片段比较多的时候，该方法需要比较长的时间。

为了解决多个片段拼接的问题，尤其是大量DNA片段需要拼接形成较长的DNA分子的问题。本发明提出了一种“递归”克隆的方法，根据该方法设计的载体和片段，可以方便地，并行和递归地将多个DNA片段首尾拼接，形成大的DNA分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将多个DNA片段首尾拼接形成更长的DNA片段的方法。

一种将多个DNA片段拼接形成更长的DNA片段的拼接方法，包括下列步骤：

1)提供一种DNA载体，所述载体上至少顺序包含四个不同的酶切位点，即酶切位点A、酶切位点B、酶切位点C和酶切位点D，其中，酶切位点A和酶切位点B之间设有载体左同源臂，酶切位点C和酶切位点D之间设有载体右同源臂；