[发明专利]一种雨生红球藻细胞周期同步化的调控方法及其应用

说明书

本发明公开了一种雨生红球藻细胞周期同步化的调控方法，包括如下步骤：成熟的雨生红球藻厚壁孢子在氮限制培养基和高光照下，同步萌发产生红色鞭毛细胞；红色鞭毛细胞发生同步孢囊化，形成厚壁孢子，上述过程周期性重复，实现雨生红球藻多个细胞周期中处于同步化生长状态。本发明还提供一种应用，在氮限制培养基接入成熟的雨生红球藻厚壁孢子，提供高光照和富二氧化碳的空气，厚壁孢子经同步萌发和同步孢囊化过程再次形成厚壁孢子；形成的厚壁孢子一部分直接收获，另一部分加入新培养基继续培养；按照上述方法周期性重复培养。本方法简单，可以获得连续多个细胞周期内同步化程度高的雨生红球藻细胞群，快速获得高虾青素含量的雨生红球藻厚壁孢子。

技术领域

本发明涉及微藻生物技术领域，尤其是一种雨生红球藻细胞周期同步化的调控方法及其应用。

背景技术

虾青素(astaxanthin)是一种氧化态的胡萝卜素。虾青素具有极强的自由基清除能力和着色性能，因此虾青素及其衍生产品在药品、保健品、护肤品及高端饲料添加剂领域已经有着广泛的应用。

培养雨生红球藻生产虾青素是生产天然虾青素的主要途径，其中虾青素的含量高达细胞干重的2％～7％，是最有潜力的产虾青素新资源，受到国内外学界和企业界的普遍关注。雨生红球藻来源的虾青素产品陆续获得GMP、FDA及欧盟新资源认证。在我国，雨生红球藻于2010年获准进入新资源产品目录(卫生部2010年第17号公告)，因此在我国雨生红球藻来源的虾青素产品拥有极大的市场。

在雨生红球藻的生活史中，存在两种富含虾青素的细胞状态：成熟的厚壁孢子和红色鞭毛细胞，分别处在不同的生活阶段。针对这两种形态的雨生红球藻细胞，国内外生产商采用两步法工艺和一步法工艺分别生产厚壁孢子或者红色鞭毛细胞。目前，虽然雨生红球藻的生产已经取得一定规模的成功培养，但是仍然存在培养周期长、虾青素含量低等问题，导致其产能不能满足企业需求。

不能很好的调控雨生红球藻的细胞周期是产生上述问题的重要原因。要解决这一问题，需要深入探讨环境因子对其细胞繁殖动力学、生长生理学和细胞虾青素积累动力学的影响。目前关于这方面的认识主要是基于细胞群体培养所得的，但是由于雨生红球藻的细胞周期演变过程复杂，在同一培养体系中，通常出现处于不同生活阶段细胞并存或者多种不同的繁殖途径并存的情况，即培养体系存在多种生长和代谢不同步的细胞群，因此部分掩盖了细胞处于不同阶段时真实的生长和代谢行为。如果应用单个细胞进行研究，由于数量太少而难以进行准确的定量分析，可行的方法是获得同步生长的细胞群来研究这一阶段细胞的真实生长和代谢情况。一些研究者采用重力沉淀或梯度离心等物理方法，利用不同阶段细胞的密度和游动性存在差异的特点，用于分选处于不同阶段的细胞群，但是这一方法需要特定设备，而且操作繁琐。另一些研究者尝试通过同步化培养获取处于同一阶段的细胞群，比如通过环境胁迫(包括氮饥饿、高光、活性氧等)诱导动孢子的孢囊化过程，或者通过变温前处理、低光诱导等手段诱导厚壁孢子同步萌发以获取动孢子。但是大多数仅实现在游孢子萌发阶段的部分同步，特别是不能实现完全的同步培养，不能满足研究需要。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种雨生红球藻细胞周期同步化的调控方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种雨生红球藻细胞周期同步化的调控方法，包括如下步骤：(1)成熟的雨生红球藻厚壁孢子，在氮限制培养基和高光照条件下，同步萌发产生红色鞭毛细胞的过程；(2)步骤(1)产生的红色鞭毛细胞发生同步孢囊化，形成厚壁孢子的过程；(3)按照步骤(1)和步骤(2)的先后次序周期性地重复，实现雨生红球藻在多个细胞周期中处于同步化生长状态。

所述步骤(1)和步骤(2)在同一反应器和同一培养条件下连续进行。

优选的，所述成熟的雨生红球藻厚壁孢子利用单一的或复合的选自氮饥饿、高光、高盐、高温或活性氧诱导剂等胁迫手段获得，细胞中类胡萝卜素/叶绿素含量比为1.0～20.0。