[发明专利]一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法

权利要求书

1.一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）选择菌株：选取的荧光标记根瘤菌Rhizobium meliloti.GN5f(R.GN5f)，其原始菌株Rhizobium meliloti.GN5(R.GN5)为分离自甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa cv .Gannong No.5)根瘤的优良根瘤菌株；通过三亲本杂交获得含有青色荧光蛋白（CFP）的內源荧光标记根瘤菌R.GN5f；

2）选取植物材料：苜蓿材料为甘农5号紫花苜蓿；

3）制备菌液：将步骤1）的菌株TY平板活化后转接入50mlTY液体培养基，28℃、180rpm/min振荡培养至菌液光密度OD_600nm 值为0.5-1，4000rpm/min离心5min，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用漩涡振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD_600nm为0.5的R.GN5f荧光标记根瘤菌液；

4）添加苦参碱：选取的苦参碱浓度为600mg/L，含量为1.3%，无菌操作台内苦参碱溶液用0.22μm无菌滤膜和无菌针管过滤灭菌后，添加至培养好的菌液中，至终浓度600mg/L；

5）接种：分别随机选取现蕾期、初花期、结荚期的苜蓿植株5株，根部10cm范围内挖深约5cm坑，露出主根、侧根、毛根，将制备好的荧光标记根瘤菌液按50ml/株均匀浇灌于根部，尔后覆土埋根；未添加苦参碱的R.GN5f接种为对照；

6）检测时期及检测组织：

a）现蕾期～成熟期：检测根、茎、叶、花、种子；

b）开花期～成熟期：检测根、茎、叶、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱头、花雄蕊的花药、花雄蕊的花丝、花瓣；

c）结荚期～成熟期：检测幼嫩种子、成熟种子、荚果皮；

7）检测方法：

①取样：分别于现蕾期、初花期、结荚期采用添加苦参碱菌液浇灌的接种方法，接种后的5d、15d、30d、60d取样检测分析，直至种子收获，以未添加苦参碱的菌液浇灌为对照；取苜蓿单株，随机分离出5-10cm深土层的毛根，茎、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下部茎、上部叶和下部叶、花丝、花瓣、胚珠、花柱、柱头、花药、荚果皮和种子；取样用自来水冲洗干净后自然晾干；

手提紫外灯平板数量检测：根、茎、叶各称取1g，花5朵/花序、荚果皮5个/花序、种子5粒/花序，放入50ml无菌三角瓶内，加入有效碘浓度为2500mg/L的碘伏消毒液淹没，震荡消毒4min后无菌水冲洗5次，至三角瓶内无泡沫状液体出现即可，完全消毒的组织分别置于无菌研钵中，加入2ml无菌水充分研磨后离心，离心转速为4000rpm/min，离心时间为5min，吸取0.2ml上清液均匀涂布于TY固体培养基，其中根研磨液依次稀释10¹-10³，三次重复，28℃培养24-48h后，黑暗中手提紫外灯下记录每皿内荧光标记根瘤菌数量，荧光标记根瘤菌在手提紫外灯下发青绿色光；

③黑白体式荧光显微镜检测：黑白体式荧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测中，含CFP标记根瘤菌的苜蓿组织为白色，未检出的组织为黑色。

2.根据权利要求1所述的一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，其特征在于， TY液体培养基的制备方法为：胰蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、CaC1₂·6H₂O 1.3g/L，pH值7.0，121℃灭菌26min。