[发明专利]一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法

说明书

技术领域：

本发明属于药物治疗肿瘤技术领域，涉及化合物与天然产物联合用药的效果测评方法，具体涉及一种利用ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合给药诱导肿瘤细胞凋亡的方法。

背景技术：

齐墩果酸((3β)-3-Hydroxyolean-12-烯-28-酸，也简称为OA)，天然五环三萜，广泛分布于各种水果、蔬菜和药材中，并具有多种生物活性。齐墩果酸已知的生物活性包括抗肿瘤，抗炎，抗高血糖，抗病毒和肝脏保护作用，而且齐墩果酸对正常细胞和组织没有显著的细胞毒作用，由于其各种生物活性和极小的细胞毒作用，齐墩果酸一直备受科学家们的关注，齐墩果酸的合成及其衍生物的合成也成为研究热点。大量证据表明，在肿瘤细胞中齐墩果酸主要通过诱导凋亡途径发挥其抗肿瘤活性，然而最近的研究表明，齐墩果酸处理的肿瘤细胞中，ERK信号通路被激活，从而引起下游信号通路中的的抗凋亡蛋白表达，降低了齐墩果酸的抗肿瘤活性。但是，利用ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合作用诱导肿瘤细胞凋亡的技术尚未见有公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种采用EPK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合给药诱导肿瘤细胞凋亡的方法，鉴于细胞凋亡的发生过程，活性氧的产生是齐墩果酸促凋亡活性的决定性因素，ERK的通路是细胞中一个关键的消除活性氧的信号通路，将ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合使用，促进活性氧的产生，增强齐墩果酸诱导凋亡的能力和抗肿瘤作用。

为了实现上述目的，本发明涉及的具体工艺步骤包括：

(1)肿瘤细胞培养：选用购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)肺腺癌A549和PANC-1胰腺癌细胞，将肺腺癌A549和PANC-1胰腺癌细胞在胎牛血清体积比为10％(英潍捷基公司)的RPMI1640肿瘤细胞培养基(Gibco)中，在CO₂体积百分比为5％的湿润37℃条件下进行培养；

(2)化学试剂和小干扰RNA的获得：齐墩果酸购自SigmaAldrich公司(货号O5504)；ERK抑制剂U0126购自细胞信号技术公司(货号#9903)；靶向ERK的小干扰RNA(siERK，货号#6560，10微摩尔/毫升)以及对应的对照小干扰RNA(货号#6568)均购自细胞信号技术公司；小干扰RNA转染试剂为英潍捷基公司的RNAiMAX(货号13778)；所有的工作液均需要在使用时现场配置，使用步骤(1)中的肿瘤细胞培养基将齐墩果酸稀释至终浓度为200微克/毫升得到齐墩果酸工作液；使用步骤(1)中的肿瘤细胞培养基将ERK抑制剂U0126稀释至终浓度为10微摩尔/毫升得到U0126工作液；将3微升小干扰RNA母液加入150微升Opti-MEM培养基，同时再将9微升小干扰RNA转染试剂加入150微升Opti-MEM培养基，将两者混合后室温环境下放置5分钟得到小干扰RNA工作液；

(3)齐墩果酸联合ERK通路抑制剂：齐墩果酸联合ERK通路抑制剂包括齐墩果酸联合U0126和齐墩果酸联合ERK小干扰RNA两种方案，其中齐墩果酸联合U0126方案是按照步骤(1)的条件培养肿瘤细胞24小时后，弃去肿瘤细胞培养基，加入步骤(2)中的U0126工作液，1小时后，加入与U0126工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后，按照步骤(4)的方法检测细胞凋亡情况；齐墩果酸联合ERK小干扰RNA是按照步骤(1)的条件将0.25×10⁶个肿瘤细胞在6孔板中培养24小时后，弃去肿瘤细胞培养基，加入步骤(2)中的小干扰RNA工作液；6小时后弃去培养基，再次加入步骤(1)的肿瘤细胞培养基，36小时后，加入与小干扰RNA工作液等体积的齐墩果酸工作液，36小时后，按照步骤(4)的方法检测细胞凋亡情况；