[发明专利]一种提高转基因鸡孵化率的方法及使用的蛋壳开口器

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高转基因鸡孵化率的方法，同时还涉及该方法使用的蛋壳开口器，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。鸡具有世代周期短、低成本、繁殖力高、卵中天然存在着蛋白酶抑制剂和良好的无菌环境，表达的重组蛋白易提纯、效益高等优点，因此转基因鸡的研究是目前科学研究的热点和生物制药领域的新兴产业之一。胚盘显微注射法是制备转基因鸡的常用手段，其中鸡蛋开窗法是鸡胚盘显微注射法的的关键技术之一，它在很大程度上决定了转基因鸡的孵化率。胚盘显微注射法必须在种蛋上打开一个小窗，这就无可避免的破外了鸡蛋外壳的正常结构，改变了蛋壳内外的压力平衡和鸡胚发育的内环境，从而造成鸡胚的非正常死亡。同时，开窗处理使蛋壳受损，极易造成鸡胚受到污染，大大降低了孵化率。因此，研发出一种行之有效的提高转基因鸡孵化率的方法具有非常重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提高转基因鸡孵化率的方法及使用的蛋壳开口器，能够有效提高转基因鸡的孵化率。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一种提高转基因鸡孵化率的方法，包括以下步骤：

(1)孵化器的消毒及种蛋的预孵化处理

对孵化器进行消毒，种蛋进行预孵化处理，放入孵化箱内开始孵化；1-18d的孵化温度为37.8℃，湿度为60％，19-21d的孵化温度为37℃，湿度为78％；

(2)种蛋的开口

开口前将蛋壳开口器和无菌操作台进行消毒，将孵化12-24h的种蛋从孵化箱内取出，在种蛋的赤道位置先用碘酊后用75％酒精擦拭消毒，用砂轮在蛋壳赤道面处研磨，一边研磨一边用酒精棉球擦拭蛋壳碎末，直至蛋壳赤道面上出现开口，观察鸡胚孵育情况；

(3)外源基因的注射

将开口后的鸡蛋，开口向上，放在操作台内静置2min，使鸡胚盘的位置漂浮在鸡蛋的开口处，将含有外源基因的转染液注射入鸡的胚盘中，用抗生素对开口处进行杀菌；

(4)种蛋的封口

种蛋的封口采用蛋清+蛋壳膜封口的方法，封口后放入孵化箱继续孵化；其中蛋清+蛋壳膜封口的方法为：将蛋壳膜在蛋清中润洗，然后在开口处覆盖第一层蛋壳膜，再在第一层蛋壳膜上交叉覆盖第二层蛋壳膜。

优选的，第一层蛋壳膜和第二层蛋壳膜呈十字形交叉覆盖。

步骤(1)中孵化器的消毒方法为：将孵化器进行清洗，关闭进出气孔和风机，按照每立方米空间高锰酸钾10g，福尔马林15mL的比例依次加入高锰酸钾和福尔马林，混合，当混合溶液冒烟时，关闭孵化器门，消毒1h，消毒温度为15-20℃，湿度≥75％；

步骤(1)中种蛋的预孵化方法为：将新洁尔灭和水按照质量比1:1000的比例配制成新洁尔灭溶液，其中水温为30℃，将种蛋浸入新洁尔灭溶液中5min，洗净，取出，用脱脂棉擦拭干净。

步骤(3)中抗生素的制备方法：将青链霉素加入生理盐水中，使其终浓度为0.1μg/μL。

所述外源基因为表达载体pEGFP-N1-p53/MAR，是将人抑癌基因p53和鸡的核基质附着区MAR基因插入表达载体中构建而成，包括如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

所述表达载体pEGFP-N1-p53/MAR的构建方法，包括以下步骤：

(1)抽取癌症病人的外周血液，提取外周血液总RNA，设计上下游引物Primera、Primerb，RT-PCR扩增人抑癌基因p53，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物并纯化回收；

RT-PCR反应体系为：2×PCRBuffer22μL，上下游引物各1.5μL，RT/TaqMasterMix2μL，总RNA模板3μL；

RT-PCR反应条件为：①cDNA合成和预变性：40℃、30min，94℃、2min；②PCR扩增共40个循环：94℃预变性30s、前5个循环65℃退火30s，后35个循环68℃退火30s、72℃延伸90s；③72℃充分延伸10min，反应结束；

(2)将质粒pMD18-T与人抑癌基因p5316℃连接过夜，得到连接产物pMD18-T-p53；将连接产物pMD18-T-p53转化感受态细胞，培养，根据上下游引物Primera、Primerb，挑取单菌落进行PCR检测，筛选出阳性菌落，提取连接产物pMD18-T-p53，再进行酶切鉴定和测序鉴定，鉴定正确的为重组质粒pMD18-T-p53；