[发明专利]一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法。此发明不仅可获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV示踪病毒，填补了国内外空白；为研究REV病毒在机体内复制，组织嗜性及其致病机理提供了材料；同时为开发REV作为病毒载体表达外源基因提供了可能。

背景技术

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)主要引起以网状内皮细胞增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。REV感染鸡群往往生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；并引起感染鸡的免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效应，导致免疫失败。该病目前已呈世界范围流行，但对其细胞感染受体、病毒复制位点及其致病机理等方面知之甚少。构建表达绿色荧光蛋白的示踪病毒已被广泛应用于病毒受体、组织嗜性及其致病机理等研究中。国内外学者也尝试将绿色荧光蛋白基因插入REV基因组，拯救表达绿色荧光蛋白的REV示踪病毒，但由于选择的插入位点的不适宜目前尚未成功获得表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。本研究将绿色荧光EGFP基因，利用商品化的重组酶ExnaseTMII，插入到REV病毒基因组合适的插入位点，构建并成功拯救出了表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。

发明内容

本发明的目的是在于构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV病毒传染性克隆，并拯救出相应病毒。本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计引物扩增出含REV传染性线性化载体以及EGFP基因片段，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，将EGFP基因片段插入到REV传染性克隆env基因的N端，在体外快速重组克隆，并将阳性克隆转染DF1细胞拯救出表达绿色荧光囊膜蛋白的REV病毒。

所述引物如下：

a，PCR扩增出REV传染性克隆SNV线性化载体；

上游引物：5′CTAATTCTCCTTGTGGCTTGGTGGGGGTTT3′(SEQIDNO.1)；

下游引物：5′GATTTTGCTCGCCTGGTCAACTTTACCCTC3′(SEQIDNO.2)。

b，PCR扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP；

上游引物：5′CAGGCGAGCAAAATCATGGTGAGCAAGGGCGAG3′(SEQIDNO.3)；

下游引物：5′CACAAGGAGAATTAGCTTGTACAGCTCGTCCAT3′(SEQIDNO.4)。

本发明公开了PCR扩增REV传染性克隆SNV线性化载体以及PCR扩增EGFP基因，用于构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的引物序列。本发明还公开了一种基于REV病毒LTR的外源基因快速构建表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的方法，是用重组酶ExnaseTMII，将线性化的REV传染性克隆载体与EGFP基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆获得表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆。

本发明一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒传染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

1)利用序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物，以REV传染性克隆质粒SNV质粒为模板，PCR扩增出SNV线性化载体；

2)利用序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4引物，以pcDNA3.1-EGFP质粒为模板，PCR扩增出绿色荧光蛋白基因EGFP；

3)利用重组酶ExnaseTMII对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆转染DF1细胞拯救出表达绿色荧光囊膜融合蛋白的REV病毒。

本发明表达绿色荧光囊膜蛋白的REV传染性克隆的构建及病毒拯救；分别以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及含EGFP基因质粒为模版，PCR分别扩增出REV传染性克隆线性化载体以及EGFP基因片段(附图1，步骤1)；并利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆(附图1，步骤2)；阳性克隆即可进行DF1细胞转染、拯救病毒(附图1，步骤3)。