[发明专利]用于孔石莼LAMP-LFD检测的引物和探针序列

说明书

本发明公开了用于孔石莼LAMP‑LFD检测的引物和探针序列，特点是根据基因库登录号为HQ902008的孔石莼内转录间隔区序列的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，利用上述的引物和探针，通过LAMP反应体系扩增步骤，探针杂交LAMP反应产物步骤，使用LFD检测步骤实现孔石莼的检测，优点是检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高。

技术领域

本发明涉及一种检测孔石莼的引物和探针序列，尤其是涉及一种用于孔石莼LAMP-LFD检测的引物和探针序列。

背景技术

孔石莼（Ulva pertusa）属于绿藻纲，石莼目，石莼科，石莼属。石莼属(Ulva)藻类呈全球性分布，多数种类生活在温带至亚热带海洋中，部分生长在高潮带至低潮带和大干潮线附近岩石上或石沼中。石莼属藻类富含蛋白和多种微量元素，具有很高的食用及药用价值。作为重要的经济藻类，孔石莼（U. pertusa）、浒苔（Ulva prolifera）等已得到越来越多的开发利用。然而，当石莼属藻类脱离固着基，形成大量的漂浮增殖群体时，将导致绿潮的爆发，破坏底栖生态系统。自20世纪70年代初法国布列塔尼沿海首次报道以来，绿潮发生范围已遍及欧洲沿海、美国东西海岸、东亚和东南亚沿海以及澳大利亚等国，成为世界性的海洋环境问题。因此，建立快速、准确、灵敏的检测孔石莼的新方法，对于绿潮的早期判断和预警、实时监测及防治具有重要的意义。

长期以来，石莼属等绿潮藻的分类鉴定主要依赖于显微镜下的形态学观察，通常以其形态、结构特征等作为主要的分类依据。然而，石莼属藻类在生长时期其形态和细胞结构上有着很好的可塑性，会随着季节和环境的变化而变化，导致形态学分类比较困难。因此，有学者试图将以PCR为代表的分子生物学技术引入到绿潮藻类的检测中，以期对传统分类方法加以辅助。其中，rDNA-ITS序列、rDNA -18s序列、二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因（rbcL）等因其种间较大的差异性，通常用作鉴定的靶标，应用于藻类的系统分类和鉴定过程。然而，PCR技术对仪器依赖性高，需要在特定环境下由专业人员操作，只适合在实验室开展。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是2000年发展起来的一种新的核酸扩增方法。相对于仅需设计1对上下游引物以扩展的传统PCR法，该方法需针对一段靶序列的不同区域设计2-3对引物，这些引物在反应过程中需完全与靶序列匹配才能完成扩增反应。因此，LAMP具有高特异性和高灵敏度。LAMP反应在恒温条件下进行，无需反复的升降温以使模板解链，一定程度上缩短了检测时间。此外，该技术对仪器设备要求低，仅一台恒温水浴锅或金属浴即可满足反应条件。因而，自该技术发明以来已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原检测中。但是，LAMP产物的检测以琼脂糖凝胶电泳法或浊度检测为主，在这点其仍然无法摆脱凝胶成像系统或浊度仪。LAMP-LFD技术以LAMP反应为基础，随后将生物素标记的LAMP产物与异硫氰酸荧光素标记的特异性探针进行杂交，最终在横向流动试纸条上完成检测并进行结果判定。相较于之前的LAMP产物检测方法，LFD便携性较好，且能够避免非特异性扩增而出现的假阳性。目前，该技术已成功运用于传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）、传染性肌肉坏死病毒（Infectious myonecrosis virus，IMNV）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus），以及海豚链球菌（Strepstococcus iniae）等水产病原微生物的检测，国内外还未见报道将该技术应用于孔石莼的诊断和检测。

发明内容