[发明专利]一种使用磁微粒化学发光定量检测抗核小体抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种使用磁微粒化学发光定量检测抗核小体抗体IgG的试剂盒，所述试剂盒包括：抗核小体抗体IgG校准品、抗核小体抗体IgG试剂1号、抗核小体抗体IgG试剂2号、抗核小体抗体IgG磁分离试剂、抗核小体抗体IgG质控品和清洗液，其特征在于：

所述抗核小体抗体IgG校准品包括6个液体校准瓶，所述液体校准瓶内目标浓度分别为0、5、20、50、100、200RU/mL的抗核小体抗体IgG和牛血清白蛋白的Tris缓冲液；

所述抗核小体抗体IgG试剂1号为1个含有生物素标记的核小体抗原和牛血清白蛋白的Tris缓冲液的瓶；

所述抗核小体抗体IgG试剂2号为1个含有碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的Tris缓冲液的瓶；

所述抗核小体抗体IgG磁分离试剂为1个含有链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白蛋白的Tris缓冲液瓶；

所述抗核小体抗体IgG质控品包括2个质控瓶，所述质控瓶内的浓度的范围分别为16-24RU/mL和80-120RU/mL。

2.一种使用磁微粒化学发光定量检测抗核小体抗体IgG的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：

步骤1.制备所述抗核小体抗体IgG校准品包括：抗核小体抗体IgG校准品稀释液配制步骤和抗核小体抗体IgG校准品配制步骤：

所述抗核小体抗体IgG校准品稀释液的配制步骤包括：

加800mL纯化水和11.2g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.5g的氯化钠和2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0-7.5，加40g的牛血清白蛋白到容器中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为7.0-7.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述校准品稀释液保存在2-8℃待用；

所述抗核小体抗体IgG校准品的配制步骤包括：

用上述抗核小体抗体IgG校准品稀释液将抗核小体抗体IgG分别配制为0、5、20、50、100、200RU/mL共6个浓度点；

步骤2.制备所述抗核小体抗体IgG试剂1号包括：抗核小体抗体IgG试剂1号稀释液配制步骤和抗核小体抗体IgG试剂1号配制步骤：

所述抗核小体抗体IgG试剂1号稀释液的配制步骤：

加800mL纯化水、12.1g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0-7.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述试剂1号稀释液保存在2-8℃待用；

所述抗核小体抗体IgG试剂1号的配制步骤：

用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照核小体抗原与生物素溶液质量比为10:1的比例在核小体抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成核小体抗原-生物素连接物的反应液，将得到的核小体抗原-生物素连接物反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到核小体抗原-生物素连接物，再用所述试剂1号稀释液将核小体抗原-生物素连接物稀释到0.1-0.3μg/mL，得到所述的试剂1号；

步骤3.制备所述抗核小体抗体IgG试剂2号包括：抗核小体抗体IgG试剂2号稀释液配制步骤和抗核小体抗体IgG试剂2号的配制步骤：

所述抗核小体抗体IgG试剂2号稀释液的配制步骤：

加800mL纯化水、6.06g的4-羟乙基哌嗪乙磺和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0.1g的ZnCl₂、0.2mL的Proclin300和0.1g的MgCl₂，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.5-8.0，用纯化水定容至1L，使用0.2um滤器过滤，将获得的所述试剂2号稀释液保存在2-8℃待用；

所述抗核小体抗体IgG试剂2号的配制步骤：

将1mg的羊抗人抗体和2-4μL的10mg/mL的偶联剂为2-亚胺四氢噻吩溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，将活化后的抗体保存在2-8℃备用，取1.5mg的碱性磷酸酶溶液，加入5mg/mL的4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2-8℃备用，再将上述活化的羊抗人抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2-8℃条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得羊抗人抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2-8℃保存备用，将羊抗人抗体-碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2号稀释液稀释到0.02-0.1μg/mL，得到所述的试剂2号；

步骤4.制备所述抗核小体抗体IgG磁分离试剂包括：抗核小体抗体IgG磁分离试剂稀释液配制步骤和抗核小体抗体IgG磁分离试剂配制步骤：

所述抗核小体抗体IgG磁分离试剂稀释液配制步骤：

加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0.2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.9-8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述磁分离试剂稀释液保存在2-8℃待用；

所述抗核小体抗体IgG磁分离试剂配制步骤：

取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用0.025mol/L的pH值为4.5-6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温下混匀2～3h，加入0.5-1.0mL新配制的浓度为10mg/mL的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30-60min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用0.025mol/L的pH值为4.5-6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4-8mg的链霉亲和素，室温混悬16-20h，再进行磁分离，去上清，用百分比浓度0.5％的牛血清白蛋白，百分比浓度0.5％脱脂奶粉和百分比浓度0.05％吐温-20的2-吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温条件下混匀2～3h，再磁分离，去上清，用磁微粒缓冲液稀释重悬到0.5mg/mL，在2～8℃下平衡16～24h，室温条件下混匀2～3h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述抗核小体抗体IgG磁分离试剂。