[发明专利]一种利用缬氨酸途径合成丙烷的大肠杆菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用缬氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

全球人口的持续增长和发展中国家经济的发展促进了化石能源的开采和使用，导致了严重的环境污染和气候变化问题。因此，开发环境友好型清洁能源具有重要的意义。

丙烷是液化石油气中的主要成分之一，具有较高的沸点和燃烧热值，因而容易进行液化和运输。其燃烧过程充分，可以与现有的内燃机和能源运输系统相兼容。此外，丙烷可用作制冷剂和喷雾推进剂，替换对臭氧层具有破坏性的氟氯烃类化合物，对环境保护亦有重要的价值。当前，石油化工业是丙烷的主要来源。鉴于丙烷的广泛应用和化石燃料资源的有限性，实现丙烷的生物合成和可再生具有重要的意义。

蓝细菌(蓝藻，Cyanobacterium)是一种能够在体内合成脂肪烃类化合物的原核微生物。Schirmer等人发现了该细菌体内合成脂肪烃的关键性基因：脂肪醛去甲酰加氧酶(Aldehyde-deformylatingoxygenase,ADO)(Schirmeretal.,2010)。ADO属于非血红素类铁蛋白超家族酶，可利用氧气将脂肪醛氧化，发生脱羰基反应，并生成甲酸和相应的脂肪烃。该酶的发现为实现丙烷的生物合成提供了可能的途径。

Kallio等人利用大肠杆菌的脂肪酸合成系统，通过过表达对丁酰ACP具有较高特异性的硫酯酶，使大肠杆菌得以特异性地合成正丁醛，再通过在该菌内同时表达的ADO，最终将正丁醛转化成丙烷，实现了丙烷的生物合成(Kallio2014)。但是，该代谢途径中脂肪酸合成系统提供的正丁醛有限，制约了丙烷产量的提升。因此，为实现丙烷产量的进一步提高，应建立一条能为ADO提供充足底物的代谢途径。

缬氨酸代谢途径是大肠杆菌内的一种氨基酸合成途径。通过过表达来自乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因Kivd，可将缬氨酸代谢途径的中间产物2-酮异戊酸转化为异丁醛(ShotaAtsumi2008)。体外加醛实验证明，异丁醛同样可以被ADO催化生成丙烷。因此，我们希望以大肠杆菌的缬氨酸代谢途径为基础，通过基因工程改造，构建出可以大量合成并累积异丁醛的菌株。再在该菌株中过表达ADO基因，催化异丁醛生成丙烷，从而建立一条新的丙烷合成途径。表达该代谢途径的大肠杆菌可为ADO提供充足的异丁醛底物，为丙烷产量的提高奠定基础。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种利用缬氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种利用缬氨酸代谢途径合成丙烷的大肠杆菌，该大肠杆菌过表达乙酰乳酸合成酶基因、2-酮酸脱羧酶基因、酮酸还原异构酶基因、二羟基酸脱水酶基因和脂肪醛去甲酰加氧酶基因，并敲除多个醛还原酶基因和全局转录因子基因。

优选地，所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因，来源于蓝藻(Cyanobacteria)。

优选地，所述乙酰乳酸合成酶基因，为来源于枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因alsS；所述2-酮酸脱羧酶基因，为来源于乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因Kivd；所述酮酸还原异构酶基因，为来源于大肠杆菌的酮酸还原异构酶基因ilvC；所述二羟基酸脱水酶基因，为来源于大肠杆菌的二羟基酸脱水酶基因ilvD；所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因，为来源于原绿球藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因PMT1231、集胞藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因sll0208、聚球藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因orf1593或点形念珠藻的脂肪醛去甲酰加氧酶基因NpunR1711。

更优选地，所述乙酰乳酸合成酶基因alsS，GeneBank登录号：CAB15618.2；所述2-酮酸脱羧酶基因Kivd，GeneBank登录号：AAS49166.1；所述酮酸还原异构酶基因ilvC，GeneBank登录号：NP_418222；所述二羟基酸脱水酶基因ilvD，GeneBank登录号：YP_026248；所述脂肪醛去甲酰加氧酶基因PMT1231，GeneBank登录号：NP_895059；脂肪醛去甲酰加氧酶基因sll0208，GeneBank登录号：NP_442147；脂肪醛去甲酰加氧酶基因orf1593，GeneBank登录号：YP_400610；脂肪醛去甲酰加氧酶基因NpunR1711，GeneBank登录号：YP_001865325。