[发明专利]从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法

权利要求书

1.从胎盘胎儿面绒毛膜中提取干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从采集盒中取出胎盘置于白瓷盘中，去除羊膜和瘀血后，使用生理盐水反复冲洗胎盘表面，进行消毒处理；

(2)转移至新白瓷盘中，剪取胎儿面绒毛膜置于100mm玻璃皿中，尽量剔除表面残留的胎盘小叶组织，剪碎至0.5mm³~1.5mm³的小块；

(3)使用300目筛网，用大量生理盐水冲洗组织小块，去除其中残留的血细胞；

(4)组织消化：使用1~2倍组织体积的混合酶，在37度恒温摇床100rpm振荡消化10min ~30min；所述混合酶包含：0.1mg/ml的I型胶原酶、0.1mg/ml的II型胶原酶、0.1mg/ml透明质酸酶、0.05mg/ml中性蛋白酶和0.02mol/L枸橼酸；

(5)消化结束后加适量FBS终止，300目滤网过滤，加大量生理盐水冲洗滤渣，获得尽量多的细胞；

(6)滤液经1000rpm~2000rpm离心5~15min后，弃上清，再加生理盐水洗涤，1000rpm~1500rpm离心2min~10min，得单核细胞；

(7)磁珠分选获得OCT-4阳性、Nanog阳性和STRO-1阴性的目标细胞。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(6)滤液经1500rpm离心10min后，弃上清，再加生理盐水洗涤，1200rpm离心5min，得单核细胞。

3.根据权利要求1的方法，其中在步骤(7)之后，还包括如下步骤：

(71)对所得目标细胞取样，细胞计数仪计数，流式细胞仪检测其活性；

(72)采用程序降温仪冻存目标细胞，储备；

(73)将目标细胞接种至多个T25培养瓶中，0.5×10⁵~2×10⁵细胞/瓶，添加干细胞培养基，传至P1代后，收获，冻存，储备，进行流式鉴定；其中所述干细胞培养基组成为：DMEM-F12培养基+10%FBS+10ng/ml成纤维细胞生长因子BFGF+10ng/mL人表皮细胞生长因子。

4.根据权利要求3的方法，其中步骤(73)中，将目标细胞接种至多个T25培养瓶中，1×10⁵细胞/瓶，添加干细胞培养基，传至P1代后，收获，冻存，储备，进行流式鉴定。

5.根据权利要求1的方法，其中所用的生理盐水是无菌的。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中将胎儿面绒毛膜剪碎至1mm³左右的小块。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中使用1.5倍组织体积的混合酶。

8.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，在37度恒温摇床100rpm振荡消化20min。

9.根据权利要求3的方法，其中步骤(73)中，将干细胞接种到无菌培养瓶内，并加入培养液，然后置于37℃、饱和湿度、CO₂体积分数为5%的培养箱内开始原代培养3~4天后；将无菌培养瓶内培养液和未贴壁的细胞倒掉，并重新加入相同体积的培养液，置于上述培养箱内继续培养直至无菌培养瓶内细胞达到75%~85%的融合度后，倒掉无菌培养瓶内培养液；将浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液按20%培养液体积的添加量加入到无菌培养瓶内，37℃消化1~5分钟后，将无菌培养液倒入无菌培养瓶内终止消化，拍打晃动培养瓶，使细胞完全脱落，将完全脱落的细胞和培养液倒入离心管内，于1000rpm~2000rpm离心5~10分钟，将离心所得的沉淀用含10%胎牛血清的培养液混匀沉淀，收集培养过程中完全脱落细胞即得到经扩增的干细胞。