[发明专利]对柠檬酸杆菌O6和O9特异的核苷酸及其应用

说明书

本发明涉及柠檬酸杆菌O6和O9血清型特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸为SEQ ID NO:1‑4所示的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测柠檬酸杆菌用PCR试剂盒。所述的柠檬酸杆菌可以取样于消化道、尿液、血液和伤口培养物的粗提液，也可以从人类和动物粪便环境中分离得到。本发明对柠檬酸杆菌O6和O9血清型特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。

技术领域

本发明涉及对柠檬酸杆菌O6和O9血清型特异的核苷酸，尤其涉及对柠檬酸杆菌O6和O9血清型O抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。

背景技术

柠檬酸杆菌（Citrobacter）是肠杆菌科中一种常见的革兰氏阴性菌，通常能够利用柠檬酸作为唯一的碳源，属于兼性厌氧菌。柠檬酸杆菌与沙门氏菌和大肠杆菌亲缘关系最近，是一种条件致病菌。

柠檬酸杆菌通过DNA杂交的方法可分为11个基因种，分别为弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)， 科氏柠檬酸杆菌(C.koseri)， 无丙二酸盐柠檬酸杆菌(C.amalonatIzcus)， 法氏柠檬酸杆菌(C.farmeri)， 杨氏柠檬酸杆菌(C.youngae)， 布氏柠檬酸杆菌(C.braakii)， 沃克曼氏柠檬酸杆菌(C.werkmanii)，塞拉克氏柠檬酸杆菌(C.sedlakif)， 啮齿类柠檬酸杆菌(C.rodentium)， 吉伦氏柠檬酸杆菌(C.gillenii)， 鼠类柠檬酸杆菌(C.murliniae)，其中对人类具有明显致病性的是弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)和科氏柠檬酸杆菌(C.koseri)。

弗氏柠檬酸杆菌能引起人的腹膜炎；科氏柠檬酸杆菌能在婴儿和免疫功能不全者中引起脑膜炎、中枢神经系统脓肿和败血症，能引起老年人的呼吸道和尿道感染，还能引起皮肤的感染等；其它一些柠檬酸杆菌可以在免疫抑制患者的腹腔内进行感染。此外，啮齿类柠檬酸杆菌对人体无明显致病性，但是是小鼠的重要黏膜致病菌，其多个致病机制与肠道致病性大肠杆菌（EPEC）和肠出血性大肠杆菌（EHEC）对人的致病机制相同，所以，啮齿类柠檬酸杆菌对小鼠的致病常被用作研究EPEC和EHEC对人体致病的模型。

柠檬酸杆菌主要定植于人类和动物肠道中，也存在于土壤、水、污水、食物等环境中，也能从消化道、尿液、血液和伤口中分离得到，也能从带有人类和动物粪便的环境中分离得到。

细菌分型与鉴定方法主要有传统表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然而，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的局限性，如血清分型这种分型方法需要制备一系列特异性抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，要得到特异性的抗血清比较麻烦，其制备和储存都存在一些困难；另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的O抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为发展方向。

柠檬酸杆菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为柠檬酸杆菌菌种与株型鉴定的重要依据，也因此产生了许多新的血清型。分子生物学检测技术具有速度快且易于大规模使用的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展方向，但当前的难点在于DNA靶标分子特异性较低。细菌表面多糖抗原的多样性是由负责其合成的基因簇的遗传多样性导致的。长期以来，人们一直试图探索柠檬酸杆菌的表面多糖抗原这一重要致病因子的多样性情况及相应的遗传进化基础。但该研究方向上总体进展非常缓慢，针对其多糖抗原多样性和变异规律方面的认识基本还是空白，例如：人们尚不了解柠檬酸杆菌中存在多少种表面多糖抗原以及哪些表面多糖抗原对于该菌的致病性和流行性具有重要意义，负责其表面多糖抗原合成的基因簇尚未被定位等。造成上述现象的主要原因是：多糖抗原合成基因簇组成复杂、基因功能较难预、糖合成基因鉴定困难等。此外，已进行部分相关研究的单位大多缺乏前期研究基础。

在本项目中，我们将在获得柠檬酸杆菌全部表面多糖抗原基因簇序列信息的基础上，建立柠檬酸杆菌分子血清学分型系统和快速检测方法，具有重要的科学意义和较强的应用价值。