[发明专利]一种牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法

说明书

本发明涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法。具体而言，本发明提供选自SEQ ID NO:1－6的引物序列，或引物组合物。本发明还提供一种检测试剂盒及检测牛传染性鼻气管炎病毒的方法。采用本发明的引物、方法和/或试剂盒可快速、方便、特异、灵敏、经济、可视化地检测牛鼻拭子、血液或其它组织中IBRV，为基层现场检测提供便利。

技术领域

本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的分子生物学检测技术，具体而言，本发明涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法。

背景技术

牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV），现称为牛疱疹病毒I型（BHV-1），是疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科成员。病毒呈球形，带囊膜，成熟粒子直径约150-220nm，主要由核酸芯髓、衣壳和囊膜3部分组成，包含基因组的核衣壳为立体对称的正二十面体，周围为一层含脂质的囊膜，其基因组可编码约70个蛋白质，gB，gC，gD和gE四个主要精蛋白基因存在于囊膜内，gB蛋白包含2个T细胞抗原表位、3个B细胞抗原表位,是IBHV主要抗原决定簇区之一，且所有的疱疹病毒科gB基因都具有高度保守性和同源性，可利用其分析不同疱疹病毒之间的进化关系。

自发现以来，各大洲具有发病报道，几乎所有国家的牛群中都能检测到IBRV抗体，IBRV的组织嗜性广，能侵害牛的呼吸系统，神经系统，生殖系统，眼角膜和消化系统，对牛造成无法恢复的损失。

目前检测IBRV的最简单快速和最灵敏的方法是PCR，通过扩增IBRV的特异性保守片段来确定检测结果。IBRV基因组能够重组到分化极慢的神经细胞中，随着宿主细胞的DNA同时复制形成潜伏感染，此时无法用分离毒株的方法确定，因此PCR对潜伏感染很有说服力，国外诊断IBRV大多使用ELISA方法，这些方法存在操作繁杂费时等缺点。由于缺乏实验室专业仪器、设备及专业人员，PCR或ELISA均很难在基层牛场应用，因此迫切需要一种敏感、特异和简便的IBRV检测的新技术。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是Notomi等在2000年发明的一种等温扩增技术，其标准方法是针对靶基因的6个特定区域设计2对特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温（65℃）条件下保温约一小时，即可完成大量核酸的扩增，凝胶电泳显示特征性梯状条带，2002年Nagamine等通过增加一对环引物，大大提高了扩增效率，使反应时间节省近一半。LAMP法是新型的基因扩增法，具有快速、方便、特异性好、灵敏度高、成本低等优点，不需要昂贵的仪器设备，仅水浴锅就可以检测，适合现场使用，这些年来，国内外已将该技术运用于多个领域，但目前均未见该技术用于检测IBRV。

LAMP技术虽然简便灵敏，但扩增产物的检测及由此带来的气溶胶污染造成的假阳性限制了该技术的推广，因此LAMP产物的易检测性是该技术诞生后的一个热点。

发明内容

本发明的目的是建立一种快速、方便、特异、灵敏、经济的用于检测牛鼻拭子、血液或其它组织中IBRV的LAMP可视化检测方法和检测试剂盒，为基层现场检测提供便利。

本发明利用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，通过3对特异性引物，基于金属指示剂——羟基萘酚蓝（HNB），从颜色上显示反应体系Mg²⁺浓度的变化，从而实现检测IBRV的可视化。

具体而言，本发明第一方面提供一种选自以下的引物序列：

CGAGCACACCAGCTACTCG（SEQ ID NO:1）；

TCTCGCAGCATTTCGTCC（SEQ ID NO:2）；

AGACCGGCTCCTTGAGGCGCGGAGCGCTTCCAGCA（SEQ ID NO:3）；