[发明专利]一种牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法

权利要求书

1.一种用于以环介导等温扩增技术检测牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白基因的引物组合物，该引物组合物含有以下引物对：

（1）CGAGCACACCAGCTACTCG（SEQ ID NO:1）；和

TCTCGCAGCATTTCGTCC（SEQ ID NO:2）；

（2）AGACCGGCTCCTTGAGGCGCGGAGCGCTTCCAGCA（SEQ ID NO:3）；和

CGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCCAGCGAGCACACGT（SEQ ID NO:4）；和

（3）TCGCGCTTGTAGTAGCCCTC（SEQ ID NO:5）；和

TGGGTGCCCAAGCGCAAA（SEQ ID NO:6）。

2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物含有全部三对引物对，每对引物对中两条引物的量相同，且引物对（1）、（2）和（3）的浓度比为1～5：6～12：2～6。

3.如权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，引物对（1）、（2）和（3）的浓度比为1～3：7～9：3～5。

4.一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有权利要求1－3中任一项所述的引物组合物。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、金属指示剂和DNA聚合酶。

6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述等温扩增缓冲液为10X等温扩增缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为8～10mM，MgSO₄的浓度为80～120mM，甜菜碱的浓度为3.5～4.5M，和所述金属指示剂是羟基萘酚蓝，其浓度为2.0～4.0mM。

7.权利要求1-3中任一项所述的引物组合物在制备用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒中的用途，所述检测采用环介导等温扩增技术扩增从牛组织中提取到的核酸，且扩增体系中含有金属指示剂，经由对比阴性对照的颜色而判断样品中是否存在牛传染性鼻气管炎病毒，其中，若样品检测结果与该阴性对照相比颜色发生改变，则表明该样品中存在牛传染性鼻气管炎病毒。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述检测具有以下一个或多个特征：

（1）扩增中使用到传染性鼻气管炎病毒gB蛋白基因的特异性引物；

（2）所述阴性对照为不含从牛组织中提取到的核酸的扩增体系；

（3）所述扩增体系含有等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和具有链置换作用的DNA聚合酶；

（4）所述检测还包括扩增阳性对照，所述阳性对照为含细胞培养株IBRV的DNA的扩增体系；扩增前，阴性对照和阳性对照管均呈紫色；扩增后，阳性对照管呈天蓝色，阴性对照管颜色不变，则判定检测结果可靠；和

（5）所述扩增包括：在63～67℃保温35～45分钟，然后在78～82℃保温15～25分钟，终止反应，从而完成扩增。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述特异性引物是gB蛋白基因保守区的特异性引物。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述阴性对照含有相同的扩增体系组分，但使用DEPC水代替核酸样品。

11.如权利要求7-10中任一项所述的用途，其特征在于，所述检测使用权利要求1-3中任一项所述的引物组合物或权利要求4－6中任一项所述的检测试剂盒进行扩增。

12.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述检测包括：

（a）提供提取自牛组织的核酸；

（b）使所述核酸与含等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和具有链置换作用的DNA聚合酶的扩增体系混合，获得样品混合物；作为阴性对照，用DEPC水替换所述核酸，与所述扩增体系混合；作为阳性对照，使用细胞培养株IBRV的DNA替换所述核酸，与所述扩增体系混合；

（c）使步骤（b）所得样品混合物、阴性对照和阳性对照在63～67℃保温35～45分钟，然后在78～82℃保温15～25分钟，终止反应，从而完成扩增；和

（d）对比扩增后阴性对照和阳性对照的颜色，在阳性对照颜色发生改变的情况下，表明检测结果可靠，在此基础上将样品颜色与阴性对照的颜色进行比较，若颜色发生变化，指示存在牛传染性鼻气管炎病毒。