[发明专利]一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统

说明书

本发明公开了一种含有启动子pYAO的表达盒甲。所述表达盒甲中由所述启动子pYAO启动Cas9核酸酶的编码基因表达；所述启动子pYAO为如下(a1)或(a2)或(a3)：(a1)序列表序列1自5'末端第1‑1012位所示的DNA分子；(a2)与(a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。实验证明，利用在植物配子体或/和胚胎发育早期高表达基因的YAO基因，驱动Cas9基因的表达，可以高效的编辑植物基因组。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统。

背景技术

实现对植物基因组进行高效、定点编辑对研究植物基因功能具有重要意义。目前，锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及CRISPR/Cas9等基因改造技术已广泛的应用于科研中，其中CRISPR/Cas9技术是近年来才发展起来的基因改造技术。CRISPR/Cas系统，为目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”。利用CRISPR/Cas9系统编辑生物基因组，在靶标片段处造成不同形式的缺失或插入已成功应用于人类细胞系、斑马鱼、大鼠、小鼠、果蝇等生物中。在植物领域，该技术也已应用于拟南芥、水稻、玉米、烟草以及番茄等植物中，但是已有的CRISPR/Cas9系统编辑效率比较低。

目前用来驱动Cas9基因表达的启动子多为CMV 35S启动子和Ubiquitin启动子，但是已有的研究表明，二者驱动的Cas9对植物基因组的编辑效率都较低，可见，选择合适的启动子驱动Cas9基因的表达对于提高其编辑效率尤其重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效定点编辑植物基因组的方法。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种含有启动子pYAO的表达盒甲。所述表达盒甲中由所述启动子pYAO启动Cas9核酸酶的编码基因表达。

所述启动子pYAO可为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表序列1自5'末端第1-1012位所示的DNA分子；

(a2)与(a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

所述Cas9核酸酶可为如下b1)或b2)：

b1)氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)将b1)所示的蛋白质经过1至10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与Cas9核酸酶具有相同功能的蛋白质。

所述表达盒甲自5’端至3’端依次可包括如下原件：所述启动子pYAO、所述Cas9核酸酶的编码基因和终止子。

所述Cas9核酸酶的编码基因可如序列表序列1自5'末端第1139-5239位所示。

所述终止子具体可为NOS终止子。所述NOS终止子的核苷酸序列可如序列表序列1自5'末端第5297-5580位所示。

所述表达盒甲中还可包括一个以上Flag标签和/或一个以上核定位信号。

所述表达盒甲中具体可包括1个Flag标签、核定位信号甲和核定位信号乙。所述表达盒甲自5’端至3’端依次可包括如下原件：所述启动子pYAO、所述Flag标签、所述核定位信号甲、所述Cas9核酸酶的编码基因、所述核定位信号乙和终止子。