[发明专利]改进的等位基因特异性扩增

说明书

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2009年10月17日；申请号：200980141303.2；发明名称：同上。

技术领域

本申请涉及改进的等位基因特异性扩增。

背景技术

核酸的等位基因特异性扩增允许靶序列的同步扩增和分析。当怀疑靶核酸在其序列中具有一个或多个具有变异（多态性）的亚群时通常使用等位基因特异性扩增。DNA多态性用于DNA序型（profile）分析（法医取证、亲子鉴定、用于器官移植的组织分型），遗传作图，以及稀有突变的检测，例如在具有正常DNA的细胞背景下在癌细胞中发生的那些稀有突变。

在成功的等位基因特异性扩增中，期望的靶核酸变体得到扩增，而其他变体不扩增，至少不扩增至可检测的水平。通常的等位基因特异性扩增测定包括聚合酶链式反应（PCR），其中至少一种引物与具有可疑多态性的区域互补。等位基因特异性引物的设计成如此以使仅在存在多态性的特定变体时才发生引物延伸。最简单形式的等位基因特异性引物具有与靶中的多态核苷酸期望变体互补的3’-端核苷酸。通常在引物3’-端的单个错配就足够阻止靶序列的非期望变体的扩增。然而，扩增的特异性在不同的3’-端序列中变化很大：一些错配有效地阻止聚合酶的延伸，而其他不能，见美国专利号5,639,611。

等位基因鉴别的成功取决于DNA聚合酶延伸错配引物的无能性（inability）。DNA聚合酶的此无能性可通过调整反应条件来调节以获得最大选择性。然而，对许多多态序列，等位基因特异性PCR的低选择性仍然是个问题。

增加特异性的一种方法包括设计具有内部错配核苷酸或多个核苷酸的扩增引物。此方法在一些系统中被证明是成功的，见美国专利号5,137,806。

增加特异性的另一种方法包括引物的化学修饰。例如，发现引物中一些核苷酸的脱氧核糖的特定2’-C和4’-C修饰提高了聚合酶的等位基因鉴别，见Gaster,J.和Marx,A.,Chem.Eur.J.2005,11:1861-1870。在另一个研究中，发现通过在引物的一个核苷酸中使用非天然嘧啶碱基，特别是在嘧啶环的6-位具有不同取代的假异胞嘧啶（pseudoisocytidine），提高了等位基因的鉴别，见美国专利号7,408,051。

在实时等位基因特异性PCR的情况下，可通过匹配和错配模板间阈值循环数（Ct）的差异来测量测定的选择性。更大的差异指示错配模板扩增的更大延迟，从而更好的鉴别等位基因。修饰的脱氧核糖已显示导致1至14个循环之间的Ct差异。假异胞嘧啶的使用导致错配模板扩增的7个循环的延迟。此程度的鉴别对许多应用是不足的，在这些应用中样品包含几种均竞争扩增的模板变体。错配模板通常以比匹配模板多许多的量存在。例如，在组织样品中，仅小部分的细胞可能是恶性的并携带等位基因特异性扩增测定靶向的突变（“匹配模板”）。正常细胞中存在的模板可能被较低效的扩增，但是正常细胞的压倒性数量将克服在扩增中的任何延迟并清除突变模板的任何优势。为了检测在野生型模板存在下的稀有突变，需要改进等位基因特异性扩增测定的特异性。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及等位基因特异性扩增的改进方法，其中在等位基因特异性引物或多个引物中的一个或多个核苷酸通过修饰基团和核碱基环外氨基的共价连接来修饰。修饰可发生在引物内部或3’-末端，或二者均有。

在第二个方面，本发明涉及以几种变体序列形式存在的靶序列变体的等位基因特异性扩增的方法，所述方法包括：

（a）提供样品，其可能含有靶序列的至少一种变体；

（b）提供第一种寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补；

（c）提供第二种寡核苷酸，其与靶序列的一种或多种变体至少部分互补，并具有至少一个与靶序列的仅一种变体互补的3’-端核苷酸；其中所述第二种寡核苷酸参入至少一个具有在环外氨基被共价修饰的碱基的核苷酸；

（d）提供适于所述第一种和第二种寡核苷酸与靶序列的至少一种变体杂交的条件；和

（e）提供适于第二种寡核苷酸通过核苷酸参入生物催化剂延伸的条件；其中当所述第二种寡核苷酸和与其具有的所述3’-端核苷酸互补的靶序列变体杂交时，所述生物催化剂能够延伸所述第二种寡核苷酸，当所述第二种寡核苷酸和与其具有的3’-端核苷酸不互补的靶序列变体杂交时，所述延伸大大降低。

在第三个方面，本发明涉及检测样品中以几种变体序列形式存在的靶序列变体的方法，所述方法包括：